Radio sensitiviteit van kanker stamcellen in longkanker cellijnen
Summary
De aanwezigheid van kanker stamcellen is in verband gebracht met recidief of slechte uitkomsten na radiotherapie. Dit manuscript beschrijft de methoden om de radio gevoeligheid van kanker stamcellen in longkanker cellijnen te bestuderen.
Abstract
De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSCs) is in verband gebracht met recidief of slechte uitkomsten na radiotherapie. Het bestuderen van radiooresistant CSCs kan aanwijzingen geven voor het overwinnen van radioresistance. Voltage-gated calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5 is gerapporteerd als een marker voor radioresistant CSCS in niet-kleincellige longkanker (nsclc) cellijnen. Met behulp van de subeenheid van calcium kanaal α2δ1 als voorbeeld van een CSC-marker worden methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs in NSCLC-cellijnen weergegeven. CSCs worden gesorteerd met putatieve markers door Flowcytometrie, en het zelfvernieuwings vermogen van gesorteerde cellen wordt geëvalueerd door Sphere Formation assay. Colony Formation Assay, die bepaalt hoeveel cellen het vermogen verliezen om afstammelingen te genereren die de kolonie vormen na een bepaalde dosis straling, wordt vervolgens uitgevoerd om de radio gevoeligheid van gesorteerde cellen te beoordelen. Dit manuscript biedt eerste stappen voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs, die de basis legt voor een beter begrip van de onderliggende mechanismen.
Introduction
Radiotherapie speelt een belangrijke rol bij de behandeling van kanker. Het bestaan van radioresistant kanker stamcellen (CSCS) kan echter leiden tot recidief of slechte resultaten na radiotherapie1,2. CSCs worden gekenmerkt door hun zelfvernieuwings capaciteit en het vermogen om heterogene kankercellen te genereren3. Gepantserd met een efficiëntere DNA-schade herstelcapaciteit of hogere niveaus van vrije radicalen opruiming systemen of andere mechanismen, CSCS zijn relatief resistent tegen radiotherapie4,5,6,7 , 8. het identificeren van CSC-markers en het verkennen van hun mechanismen zal de ontwikkeling van geneesmiddelen die radioresistance zullen overwinnen, vergemakkelijken zonder de normale weefselschade te verhogen.
Voltage-gated calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5 is gerapporteerd als een marker voor radioresistant CSCS in nsclc cellijnen9. α2δ1 werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een CSC-marker voor hepatocellulair carcinoom (HCC)10. Met behulp van subtractieve immunisatie met een paar HCC cellijnen afgeleid van de primaire en terugkerende tumoren in dezelfde patiënt, werd een antilichaam genaamd 1B50-1 geïdentificeerd om terugkerende HCC-cellen specifiek te targeten. 1B50-1-positieve cellen toonden een hoge mate van efficiëntie in vitro en hoge tumorigeniteit in vivo. Het antigeen werd geïdentificeerd door massaspectrometrie, als calcium kanaal α2δ1 subeenheid isovorm 5. α2δ1 drukt specifiek in CSCs uit en is niet detecteerbaar in de meeste normale weefsels, waardoor het een potentiële kandidaat is voor het targeten van CSCs10. α2δ1 kan ook dienen als een CSC-marker voor NSCLC-cellijnen, en het is aangetoond dat radioresistance wordt gegeven aan NSCLC-cellen, deels door het verbeteren van de efficiëntie van DNA-schade herstel in reactie op straling9.
Het bestuderen van radiooresistant CSCs kan aanwijzingen geven voor het overwinnen van radioresistance. Met behulp van α2δ1 in NSCLC als voorbeeld worden belangrijke methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs gepresenteerd. Gewoonlijk worden CSCs geïsoleerd met een putende oppervlak marker en worden de eigenschappen van de stamcel en de radio gevoeligheid van de positieve en negatieve celpopulaties vergeleken. Sphere Formation in een serumvrij medium aangevuld met groeifactoren die de zelf vernieuwing ondersteunen, is een nuttige assay om de hoeveelheid cellen in vitro te evalueren. Cellen met hoge bol vorming capaciteit vertonen waarschijnlijk hoge tumorigeniteit wanneer geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen10,11,12. Kolonie vorming assay wordt vervolgens gebruikt om te beoordelen van de radio sensitiviteit van cellen, die bepaalt hoeveel hebben verloren het vermogen om te genereren van afstammelingen vormen de kolonie na een dosis straling13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van de radio gevoeligheid van CSCs in kanker cellijnen in vitro. In deze studie is de expressie van α2δ1 continu in NSCLC-cellijnen. Daarom is gating gebaseerd op een Isotype-regeling. Alvorens te sorteren, moet de α2δ1-uitdrukking in meerdere cellijnen worden onderzocht door Flowcytometrie en gevalideerd door QPCR of Western Blot. Het wordt aanbevolen om α2δ1-expressie van de gesorteerde α2δ1-hoog en α2δ1-lage cellen opnieuw te analyseren door middel van Flo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81402535 en 81672969) en het National Key Research and Development project (2016YFC0904703).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells–perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. 암 연구학. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. 암 연구학. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O’Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
