肺癌細胞株における癌幹細胞の放射線感受性
Summary
癌幹細胞の存在は、放射線療法後の再発または悪い結果に関連している。本原稿では、肺癌細胞株における癌幹細胞の放射線感受性を調べた方法について述べている。
Abstract
癌幹細胞(CSC)の存在は、放射線療法後の再発または悪い結果と関連している。放射線抵抗CSCを研究することは、放射線抵抗を克服する手がかりを提供するかもしれません。電圧ゲートカルシウムチャネルα2δ1サブユニットアイソフォーム5は、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株における放射線耐性CSCのマーカーとして報告されている。CSCマーカーの一例としてカルシウムチャネルα2δ1サブユニットを用いて、NSCLC細胞株におけるCSCの放射感受性を調べた方法が提示される。CSCは、フローサイトメトリーによって置きマーカーでソートされ、選別された細胞の自己再生能力は球体形成アッセイによって評価される。コロニー形成アッセイは、一定量の放射線の後にコロニーを形成する子孫を生成する能力を失う細胞の数を決定し、次いでソートされた細胞の放射感受性を評価するために行われる。この原稿は、CSCの放射感受性を研究するための最初のステップを提供し、基礎となるメカニズムをさらに理解するための基礎を確立する。
Introduction
放射線療法はがん治療において重要な役割を果たしている。しかし、放射線耐性癌幹細胞(CSC)の存在は、放射線治療後の再発または不良な結果につながる可能性があります 1,2.CSCは、自己再生能力と異発癌細胞3を生成する能力によって特徴付げられる。より効率的なDNA損傷修復能力またはフリーラジカル清掃システムまたは他のメカニズムのより高いレベルを持つ装甲、CSCは放射線療法4、5、6、7に対して比較的耐性がある,8.CSCマーカーを同定し、そのメカニズムを探索することは、正常な組織損傷を増加させることなく放射線抵抗を克服する薬剤の開発を容易にする。
電圧ゲートカルシウムチャネルα2δ1サブユニットアイソフォーム5は、NSCLC細胞株9における放射性CSCのマーカーとして報告されている。α2δ1は、もともと肝細胞癌(HCC)10のCSCマーカーとして同定された。同じ患者の一次腫瘍および再発性腫瘍に由来する一対のHCC細胞株を用いて、1B50-1という抗体を用いて、再発性HCC細胞を特異的に標的とすることを同定した。1B50-1陽性細胞は、インビトロにおける高球形成効率および生体内における高い腫瘍原性を示した。その抗原は質量分析により同定され、カルシウムチャネルα2δ1サブユニットアイソフォーム5として同定された。α2δ1はCSCで特異的に発現し、ほとんどの正常組織では検出不可能であり、CSC10を標的とする候補として潜在的な候補である。α2δ1はNSCLC細胞株のCSCマーカーとしても機能することができ、放射線9に応答してDNA損傷修復の効率を高めることにより、NSCLC細胞に対する放射線耐性を部分的に付与することが示されている。
放射線抵抗CSCを研究することは、放射線抵抗を克服する手がかりを提供するかもしれません。NSCLCにおけるα2δ1を例にとり、CSCの放射感受性を調べた主な方法を紹介する。通常、CSCは置き面マーカーで単離され、陽性および陰性の細胞集団の幹細胞特性と放射感受性が比較される。自己再生を支持する成長因子を補う無血清培地中の球体形成は、インビトロの細胞の幹を評価するのに有用なアッセイである。球体形成能力の高い細胞は、免疫不備マウス10、11、12に注射すると高い腫瘍原性を示す可能性が高い。次いでコロニー形成アッセイは、細胞の放射感受性を評価するために使用され、放射線13の線量後にコロニーを形成する子孫を生成する能力を失った人の数を決定する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、インビトロの癌細胞株におけるCSCの放射感受性を研究する方法について説明する。本研究では、α2δ1の発現はNSCLC細胞株において連続的である。したがって、ゲーティングはアイソタイプコントロールに基づいています。並べ替えの前に、α2δ1式は、フローサイトメトリーによって複数の細胞株で調べられ、QPCRまたはウェスタンブロットによって検証されるべきである。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(81402535および81672969)と国家主要研究開発プロジェクト(2016YFC0904703)によって支援されました。
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
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