Ein einfacher Ansatz zur Durchführung von TEER-Messungen mit einem selbst gefertigten Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz
Summary
Hier zeigen wir, wie man ein kostengünstiges Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz aufstellt, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für transepitheliale/endotheliale elektrische Widerstandsmessungen verwendet werden kann.
Abstract
Transepitheliale/endotheliale elektrische Beständigkeit (TEER) wird seit den 1980er Jahren verwendet, um die Konfluenz und Durchlässigkeit von In-vitro-Barrieremodellsystemen zu bestimmen. In den meisten Fällen werden Essstäbchenelektroden verwendet, um die elektrische Impedanz zwischen dem oberen und unteren Fach eines Zellkulturfiltereinsatzsystems zu bestimmen, das zelluläre Monolayer enthält. Die Filtermembran ermöglicht es den Zellen, durch den Bau enger Knoten zu haften, zu polarisieren und zu interagieren. Diese Technik wurde mit einer Vielzahl von verschiedenen Zelllinien beschrieben (z. B. Zellen der Blut-Hirn-Schranke, Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsbarriere, oder Magen-Darm-und Lungentrakt). TEER Messgeräte können leicht von verschiedenen Laborgerätelieferanten bezogen werden. Es gibt jedoch kostengünstigere und anpassbare Lösungen, die sich vorstellen können, wenn ein geeignetes Voltammeter selbst montiert wird. Das übergeordnete Ziel dieser Publikation ist die Einrichtung eines zuverlässigen Gerätes mit programmierbarer Ausgangsfrequenz, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für die TEER-Messung verwendet werden kann.
Introduction
Epithel- und Endothelzellen fungieren als zelluläre Grenzen, die die apikalen und basolateralen Seiten des Körpers trennen. Wenn sie durch enge Knoten verbunden sind, wird die passive Substanzdiffusion durch die parazellulären Räume eingeschränkt1, was zur Bildung einer selektiv durchlässigen Barriere führt. Mehrere künstliche Barrieresysteme wurden2 mit mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC, Blut-Hirn-Schranke3,4,5,6,7), Aderhautplexus entwickelt Epithelzellen (HIBCPP/PCPEC, Blut-Zerebrospinalflüssigkeitsbarriere8,9,10,11,12,13,14), kolorektalen Adenokarzinomzellen (Caco-2, Gastrointestinale Modelle15), oder Atemwegs-/Alveolarzelllinien (Lungenmodelle16,17). Diese Systeme bestehen in der Regel aus Zellen, die in einer Monoschicht auf durchlässigen Membranen (d. h. Filtereinsatzsystemen) angebaut werden, um den Zugang zu den apikalen und basolateralen Seiten zu ermöglichen. Es ist wichtig, dass die Integrität des Modellsystems den in vivo-Bedingungen entspricht. Daher wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Barrierefunktion zu analysieren, indem parazelluläre Diffusion von Tracerverbindungen über die Zellschicht gemessen wird. Zu diesen Stoffen gehören radioaktiv markierte Saccharose, farbstoffmarkiertes Albumin, FITC-markiertes Inulin oder mit Farbstoff gekennzeichnetes Dextrans2. Chemische Farbstoffe können jedoch Zellen für weitere Experimente unbrauchbar machen. Zur Nichtinvasiven Überwachung von Barrieresystemen kann die Messung des transepitheliaalen/transendotheliaalen elektrischen Widerstands (TEER) über eine zelluläre Monoschicht2,18,19verwendet werden. Da bipolare Elektrodensysteme durch die Elektrodenpolarisationsimpedanz an der Elektroden-Elektrolyt-Schnittstelle beeinflusst werden, werden tetrapolare Messungen in der Regel verwendet, um diese Einschränkung zu überwinden20. Die Unterlagetechnik ist eine vierterminale Sensorik (4T), die erstmals 1861 von William Thomson (Lord Kelvin)21beschrieben wurde. Kurz gesagt, wird der Strom durch ein Paar stromtragender Elektroden injiziert, während ein zweites Paar spannungsempfindlicher Elektroden verwendet wird, um den Spannungsabfall20zu messen. Heute bestehen sogenannte Essstäbchenelektroden aus einem Paar Doppelelektroden, die jeweils ein Silber/Silberchlorid-Pellet zur Spannungsmessung und eine Silberelektrode zum Passieren des Stroms2enthalten. Die elektrische Impedanz wird zwischen dem apikalen und dem basolateralen Fach mit der Zellschicht dazwischen gemessen (Abbildung 1). An den äußeren Elektroden wird ein Rechtecksignal mit einer Frequenz von typischerweise 12,5 Hz aufgebracht und der resultierende Wechselstrom (AC) gemessen. Zusätzlich wird der potenzielle Tropfen über die Zellschicht durch das zweite (innere) Elektrodenpaar gemessen. Die elektrische Impedanz wird dann nach Ohms Gesetz berechnet. TEER-Werte werden durch Multiplikation der Impedanz und der Zellschichtoberfläche normalisiert und werden in der Regel in der Zeit als cm2ausgedrückt.
Es gibt Systeme, in denen Zellen und Elektroden ausgefeilter angeordnet sind, aber auch auf dem 4T-Messprinzip basieren und mit den gleichen Messgeräten eingesetzt werden können. EndOhm-Systeme, bei denen der Filter eingesetzt wird, enthalten beispielsweise eine Kammer und eine Kappe mit einem Paar konzentrischer Elektroden mit der gleichen Struktur wie die Esssstiftelektrode. Die Form der Elektroden ermöglicht einen gleichmäßigeren Stromdichtefluss über die Membran, wodurch die Streuung zwischen den Messwerten reduziert wird. Noch komplexer (aber auch genauer) ist eine Ussing-Kammer, in der eine Zellschicht zwei Kammern trennt, die mit Ringers Lösung22gefüllt sind. Die Kammer selbst kann mit Sauerstoff,CO2oderN2vergast und gerührt oder mit Experimentellen Stoffen ergänzt werden. Wenn der Ionentransport über die Zellschicht erfolgt, kann ein potenzieller Unterschied durch zwei spannungsempfindliche Elektroden in der Nähe des Gewebes gemessen werden. Diese Spannung wird durch zwei stromführende Elektroden, die neben der Zellschicht platziert werden, aufgehoben. Der gemessene Strom gibt dann den Netzionentransport und der transepitheliale Widerstand, der die Barriereintegrität widerspiegelt, kann bestimmt werden22. TEER-Messungen können auch auf Body-on-a-Chip-Systeme angewendet werden, die Barrieregewebemodelle23,24darstellen. Diese Systeme imitieren in vivo Bedingungen der Zellen und bestehen oft aus mehreren Arten von Zellen, übereinander in Schichten gestapelt.
Im folgenden Protokoll wird erläutert, wie ein kostengünstiges und zuverlässiges Voltammeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz eingerichtet wird, das keine statistisch signifikanten Unterschiede in TEER im Vergleich zu handelsüblichen Messsystemen erzeugt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bevor ein selbstgebautes Voltammeter in einer täglichen Routine verwendet werden kann, ist es wichtig, das Gerät auf die ordnungsgemäße Funktion zu überprüfen. In unserem Fall wurde eine Halbzeitschwingung von 40 ms (12,5 Hz) programmiert, aber die effektive Schwingungszeit betrug 60 ms (16,7 Hz). Diese Ungenauigkeit des Zeitemitters des Mikrocontrollers hatte keine nachweisbaren Auswirkungen auf TEER-Messungen. Es könnte am besten sein, die tatsächliche Frequenz mithilfe der Frequenzeinstellung eines der Multime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Herman Liggesmeyer und Marvin Bende für ihre fachkundige Beratung in Elektrotechnik und Informatik.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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