Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída
Summary
Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.
Abstract
A resistência elétrica transepielial/endotelial (TEER) tem sido utilizada desde a década de 1980 para determinar a confluência e a permeabilidade dos sistemas de barreira in vitro. Na maioria dos casos, os elétrodos do chopstick são usados para determinar a impedância elétrica entre o compartimento superior e mais baixo de um sistema da inserção do filtro da cultura da pilha que contem monolayers celulares. A membrana do filtro permite que as células aderem, polarizar e interagir construindo junções apertadas. Esta técnica foi descrita com uma variedade de linhas de pilha diferentes (por exemplo, pilhas da barreira do sangue-cérebro, da barreira sangue-cerebrospinal do líquido, ou do intervalo gastrintestinal e pulmonar). Os dispositivos da medida de TEER podem prontamente ser obtidos dos fornecedores diferentes do equipamento de laboratório. No entanto, há soluções mais rentáveis e personalizáveis imagináveis se um voltamômetro apropriado for automontado. O objetivo geral desta publicação é configurar um dispositivo confiável com freqüência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medição TEER.
Introduction
As células epiteliais e endoteliais funcionam como limites celulares, separando os lados apical e basolateral do corpo. Se forem conectados através de junções apertadas, a difusão passiva da substância através dos espaços transcelulares paracelulares é restringida1, tendo por resultado a formação de uma barreira seletivamente permeável. Vários sistemas de barreira artificial foram desenvolvidos2 usando células endoteliais microvasculares (hbmec, barreira hematoencefálica3,4,5,6,7), plexocoróide células epiteliais (hibcpp/pcpec, barreira hemato-liquórica8,9,10,11,12,13,14), células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2, modelos gastrintestinais15), oulinhagens de células aéreas/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estes sistemas consistem tipicamente nas pilhas crescidas em um monocamada em membranas permeáveis (isto é, sistemas da inserção do filtro) para permitir o acesso aos lados apical e basolateral. É importante que a integridade do sistema modelo corresponda às condições in vivo. Assim, várias técnicas foram desenvolvidas para analisar a função de barreira medindo a difusão paracelular de compostos traçador em toda a camada celular. Essas substâncias incluem sacarose radiomarcada, albumina rotulada com corante, inulina rotulada com FITC ou dextranos2rotulado com corante. No entanto, corantes químicos podem tornar as células inutilizáveis para outras experiências. Para monitorar os sistemas de barreira de forma não invasiva, a mensuração da resistência elétrica transepielial/transendotelial (teer) em monocamada celular pode ser utilizada2,18,19. Porque os sistemas do elétrodo bipolar são influenciados pela impedância da polarização do elétrodo na relação do elétrodo-eletrólito, as medidas tetrapolar são usadas geralmente para superar esta limitação20. A técnica de underpostura é uma detecção de quatro terminais (4T) que foi descrita pela primeira vez em 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. Em suma, a corrente é injetada por um par de eletrodos de transporte atual, enquanto um segundo par de eletrodos de detecção de voltagem é usado para medir a queda de tensão20. Hoje em dia, os chamados elétrodos do chopstick consistem em um par de elétrodos dobro, cada um que contem uma pelota da prata/prata-cloreto para medir a tensão e um elétrodo de prata para passar a corrente2. A impedância elétrica é medida entre o compartimento apical e o basolateral com a camada celular entre (Figura 1). Um sinal de onda quadrada em uma freqüência de tipicamente 12,5 Hz é aplicado nos eletrodos externos e a corrente alternada resultante (AC) medida. Adicionalmente, a gota potencial através da camada da pilha é medida pelo segundo par (interno) do elétrodo. A impedância elétrica é então calculada de acordo com a lei de Ohm. Os valores de TEER são normalizados multiplicando a impedância e a área de superfície da camada celular e são tipicamente expressos em Ω ∙ cm2.
Há os sistemas em que as pilhas e os elétrodos são arranjados em uma maneira mais sofisticada, mas são baseados igualmente no princípio de medição 4T e podem ser usados com os mesmos dispositivos da medida. Os sistemas de EndOhm, por exemplo, em que o filtro é introduzido, contêm uma câmara e um tampão com um par de elétrodos concêntricos com a mesma estrutura que o elétrodo do chopstick. A forma dos eletrodos permite um fluxo de densidade de corrente mais uniforme em toda a membrana, reduzindo assim a variação entre as leituras. Ainda mais complexo (mas também mais preciso) é uma câmara Ussing, onde uma camada celular separa duas câmaras preenchidas com solução de Ringer22. A própria câmara pode ser gaseificada com oxigénio, CO2ou N2, e agitada ou suplementada com substâncias experimentais. Porque o transporte do íon através da camada da pilha ocorre, uma diferença potencial pode ser medida por dois elétrodos tensão-detectando perto do tecido. Esta voltagem é cancelada por dois eletrodos de transporte de corrente colocados ao lado da camada celular. A corrente medida dará então o transporte de íons líquidos e a resistência transepitelial, que reflete a integridade da barreira, pode ser determinada22. A medida de teer pode igualmente ser aplicada nos sistemas Body-on-a-chip que representam os modelos de barreira-tecido23,24. Estes sistemas imitam in vivo as condições das células e muitas vezes consistem em vários tipos de células, empilhadas em cima umas das outras em camadas.
O protocolo a seguir explica como configurar um voltamômetro econômico e confiável com frequência de saída programável que não produz diferenças estatisticamente significativas no TEER em comparação com os sistemas de medição disponíveis comercialmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antes que um voltamômetro self-made possa ser usado em uma rotina diária, é essencial verific o dispositivo para a função apropriada. No nosso caso, uma meia-hora de oscilação de 40 MS (12,5 Hz) foi programada, mas o tempo de oscilação efetivo acabou por ser de 60 MS (16,7 Hz). Esta imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador não teve nenhum impacto detectável em medidas de TEER. Talvez seja melhor determinar a freqüência real usando a configuração de freqüência de um dos multímetros. Se algum d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Herman Liggesmeyer e Marvin Bende pelo seu aconselhamento especializado em Eletrotécnica e informática.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
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