JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
화학

Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides

Published: September 07, 2019
doi:
10.3791/60102
, , , ,
1Department of Chemistry,Texas A&M University-Commerce

Summary

Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.

Abstract

Elektro spray ionisatie (ESI) kan een waterige-fase peptide of peptide complex overdragen naar de gasfase terwijl het de massa, totale lading, metaal bindende interacties en conformationele vorm behouden. Koppeling ESI met Ion Mobility-massaspectrometrie (IM-MS) biedt een instrumentale techniek die gelijktijdige meting van de massa-to-charge (m/z) en Collision cross sectie (CCS) van een peptide die betrekking hebben op zijn stoichiometry, protonatie toestand, en conformationele vorm. De totale lading van een peptide complex wordt gecontroleerd door de protonatie van 1) de peptide zure en fundamentele sites en 2) de oxidatietoestand van de metalen Ion (s). Daarom is de totale charge toestand van een complex een functie van de pH van de oplossing die de peptiden metaal ion binding affiniteit beïnvloedt. Voor ESI-IM-MS-analyses worden peptide-en metaalionen oplossingen bereid uit waterige oplossingen, waarbij de pH wordt aangepast met verdund waterig azijnzuur of ammoniumhydroxide. Dit maakt het mogelijk om pH-afhankelijkheid en metaalionen selectiviteit te bepalen voor een specifiek peptide. Verder kan de m/z en CCS van een peptide complex worden gebruikt met B3LYP/LanL2DZ moleculaire modellering om bindende locaties van de metaalionen coördinatie en tertiaire structuur van het complex te onderscheiden. De resultaten laten zien hoe ESI-IM-MS de selectieve chelerende werking van een set alternatieve methanobactin peptiden kan karakteriseren en vergelijken met de koper bindende peptide methanobactin.

Introduction

Koper en zink ionen zijn essentieel voor levende organismen en cruciaal voor processen met inbegrip van oxidatieve bescherming, weefsel groei, ademhaling, cholesterol, glucose metabolisme, en genoom lezing1. Om deze functies mogelijk te maken, nemen groepen zoals het thiolaat van CYS, imidazol van zijn2,3, (meer zelden) verschillende van methionine en carboxylaat van Glu en ASP selectief metalen op als cofactoren in de actieve gebieden van metalloenzymen. De gelijkenis van deze coördinatiegroepen werpt een intrigerende vraag op over hoe de liganden van zijn en CYS selectief cu (I/II) of Zn (II) opnemen om een correcte werking te garanderen.

Selectieve binding wordt vaak bewerkstelligd door peptiden voor acquisitie en handel, die Zn (II) of cu (I/II) ionen concentraties controleren4. Cu (I/II) is zeer reactief en veroorzaakt oxidatieve schade of onvoorziene binding aan enzymen, dus de vrije concentratie is strak gereguleerd door koperen chaperonnes en koper-regulerende eiwitten die het veilig vervoeren naar verschillende locaties in de cel en strak controle van de homeostase5,6. Verstoring van het koper metabolisme of homeostase is direct betrokken bij Menkes en de ziekte van Wilson7 evenals kanker7 en neurale aandoeningen, zoals prion8 en de ziekte van Alzheimer9.

De ziekte van Wilson wordt geassocieerd met verhoogde koper niveaus in de ogen, de lever en de delen van de hersenen, waar de redoxreacties van Cu (I/II) reactieve zuurstof soorten produceren, waardoor hepatolenticulaire en neurologische degeneratie. Bestaande chelatie therapieën zijn het kleine thiolaminozuur Penicillamine en Triethyleentetramine. Als alternatief, de methanotrofische koper-acquisitie peptiden methanobactin (MB)10,het therapeutischepotentieel vertonen door hun hoge binding affiniteit voor cu (I)12. Toen de methanobactin (MB-OB3b) uit Methylosinus trichosporium OB3b werd bestudeerd in een diermodel van de ziekte van Wilson, werd koper efficiënt uit de lever gehaald en uitgescheiden via de gal13. In vitro experimenten bevestigd dat MB-OB3b het koper kan cheleren uit de koper metallothioneïneproductie opgenomen in de lever cytosol13. Laser ablatie inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie beeldvormende technieken hebben de ruimtelijke verdeling van koper in de ziekte van Wilson lever monsters14,15,16 onderzocht en aangetoond dat MB-OB3b verwijdert het koper met korte behandelingsperioden van slechts 8 dagen17.

De MB-OB3b zal ook binden aan andere metaalionen, waaronder AG (I), au (III), PB (II), MN (II), Co (II), Fe (II), ni (II) en Zn (II)18,19. Competitie voor de fysiologische cu (I) binding site wordt tentoongesteld door AG (I) omdat het cu (I) kan verdringen van het MB-OB3b complex, met zowel AG (I) en ni (II) ook tonen onomkeerbare binding aan MB die niet kan worden verplaatst door cu (I)19. Onlangs is een reeks alternatieve methanobactin (amb) oligopeptides met het 2his-2cys binding motief onderzocht20,21, en hun Zn (II) en cu (I/II) binding eigenschappen gekarakteriseerd. Hun primaire aminozuur sequenties zijn vergelijkbaar, en ze bevatten allemaal de 2His-2Cys motief, Pro en een geacetseerd N-Terminus. Ze verschillen voornamelijk van MB-OB3b omdat het 2His-2Cys motief de twee enethiol oxazolone binding sites van MB-OB3b vervangt.

Elektro spray-ionisatie in combinatie met ionen mobiliteit-massaspectrometrie (ESI-IM-MS) voorziet in een krachtige instrumentale techniek voor het bepalen van de metaal bindende eigenschappen van peptiden omdat het hun massa-tot-lading (m/z) en botsing doorsnede (CCS) terwijl de massa, lading en conformatie vorm van de oplossingsfase behouden blijven. De m/z en CCS hebben betrekking op de peptiden stoichiometrie, protonatie toestand en conformationale vorm. Stoichiometrie wordt bepaald omdat de identiteit en het nummer van elk element dat aanwezig is in de soort expliciet worden geïdentificeerd. De totale lading van het peptide complex heeft betrekking op de protonatie toestand van de zure en fundamentele plaatsen en de oxidatietoestand van het metaal ion (s). De CCS geeft informatie over de conformationele vorm van het peptide complex, omdat het de rotatie gemiddelde grootte meet die betrekking heeft op de tertiaire structuur van het complex. De totale laadtoestand van het complex is ook een functie van pH en beïnvloedt de metaalionen binding van de peptide, omdat de gedeprotoneerde basis-of zure plaatsen zoals de carboxyl, his, CYS en Tyr ook de potentiële bindingsplaatsen voor het metaal-ion zijn. Voor de analyses worden de peptide en het metaal ion bereid in waterige oplossingen met de pH aangepast door verdund waterig azijnzuur of ammoniumhydroxide. Hierdoor kan de pH-afhankelijkheid en de selectiviteit van de metaalionen worden bepaald voor de peptide. Bovendien kunnen de m/z en CCS bepaald door ESI-im-MS worden gebruikt met B3LYP/LanL2DZ moleculaire modellering om het type van de metaalionen coördinatie en tertiaire structuur van het complex te ontdekken. De resultaten in dit artikel laten zien hoe ESI-IM-MS de selectieve chelerende werking van een set amb peptiden kan karakteriseren en vergelijken met de koper bindende peptide MB-OB3b.

Protocol

1. bereiding van de reagentia Cultuur methylosinus trichosporium OB3b, Isoleer de Cu (I)-gratis MB-OB3b18,22,23, Vries droog het monster en bewaar bij-80 °c tot gebruik. Synthetiseren van de amb peptiden (> 98% zuiverheid voor amb1, amb2, amb4; > 70% zuiverheid voor amb7), vriesdrogen de monsters, en bewaar ze bij-80 °c tot gebruik. Aankoop > 98…

Representative Results

Metalen binding van amb1De IM-MS studie20 van amb1 (Figuur 1A) toonde aan dat zowel koper-als zink ionen gebonden aan amb1 in een pH-afhankelijke manier (Figuur 2). Echter, koper en zink gebonden aan amb1 door middel van verschillende reactiemechanismen op verschillende coördinatie-sites. Bijvoorbeeld, het toevoegen van Cu (II) aan amb1 resulteer…

Discussion

Kritieke stappen: behouden oplossingsfase gedrag voor onderzoek via ESI-im-MS
Native ESI instrumentale instellingen moeten worden gebruikt die behoud van de peptiden stoichiometrie, Charge State, en conformationele structuur. Voor inheemse omstandigheden moeten de omstandigheden in de ESI-bron, zoals de kegel spanningen, temperaturen en gasstromen, worden geoptimaliseerd. Ook moeten de druk en spanningen in de bron, val, Ion mobiliteit en overdracht reizen golven (vooral de DC-trap bias die de injecti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit materiaal is gebaseerd op het werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder 1764436, NSF-instrument ondersteuning (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014) en computerbronnen van het ministerie van energie (TX-W-20090427-0004-50) en L3 Communications . We danken de Bowers groep van de Universiteit van Californië-Santa Barbara voor het delen van het Sigma-programma en Ayobami Ilesanmi voor het demonstreren van de techniek in de video.

Materials

acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, &. #. 1. 9. 3. ;. Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson’s disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson’s disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson’s disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility – mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
  35. . Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).

Tags

Keywords: Ion Mobility-mass SpectrometryIM-MSMetal Ion RecognitionRedox ActivityMetal Binding OligopeptidesMolecular ModelingTertiary StructureMetal CorrelationESI-IM-MSPoly-DL-alanineAlternative MethanobactinPH-dependent RedoxMethyl Binding ReactionProduct IonsStoichiometryProtonation StateConformational StructureMetal Chelating PeptidesTherapeuticsMenkes DiseaseWilson’s DiseaseCancerAlzheimer’s DiseaseNative ESI-IM-MSNegative IonPositive IonAcetic AcidAmmonium HydroxideMass-to-chargeIsotope Pattern
check_url/kr/60102?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image