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화학

금속 결합 올리고펩타이드의 금속 이온 인식 및 Redox 활성의 구조 및 메커니즘을 결정하기 위한 이온 이동성 질량 분광법 기술

Published: September 07, 2019
doi:
10.3791/60102
, , , ,
1Department of Chemistry,Texas A&M University-Commerce

Summary

이온 이동성 질량 분광법 및 분자 모델링 기술은 설계된 금속 결합 펩타이드 및 구리 결합 펩티드 메탄오박틴의 선택적 금속 킬레이트화 성능을 특성화할 수 있다. 금속 킬레이트 펩티드의 새로운 클래스를 개발하는 것은 금속 이온 과다 균형과 관련된 질병에 대한 치료제로 이어질 도움이 될 것입니다.

Abstract

전기 분무 이온화 (ESI)는 질량, 전체 전하, 금속 결합 상호 작용 및 형태 모양을 보존하면서 수성 상 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 가스 상으로 전달할 수 있습니다. ESI와 이온 이동성 질량 분석법(IM-MS)을 결합하면 화학조량계, 프로토네이션 상태와 관련된 펩타이드의 질량 대 충전(m/z) 및 충돌 단면(CCS)을 동시에 측정할 수 있는 기법 기술을 제공합니다. 및 형태 모양. 펩티드 복합체의 전체 전하는 1) 펩티드의 산성 및 기본 부위및 2) 금속 이온의 산화 상태의 프로토네이션에 의해 조절된다. 따라서, 복합체의 전체 전하 상태는 펩티드 금속 이온 결합 친화도에 영향을 미치는 용액의 pH의 함수이다. ESI-IM-MS 분석의 경우, 펩타이드 및 금속 이온 용액은 수성 전용 솔루션에서 제조되며, pH는 희석 된 수성 아세트산 또는 수산화 암모늄으로 조정됩니다. 이는 pH 의존성 및 금속 이온 선택성을 특정 펩티드에 대해 결정하도록 허용한다. 또한 펩타이드 복합체의 m/z 및 CCS는 B3LYP/LanL2DZ 분자 모델링과 함께 사용하여 복합체의 금속 이온 조정 및 삼차 구조의 결합 부위를 식별할 수 있습니다. 결과는 ESI-IM-MS가 대체 메탄백틴 펩타이드 세트의 선택적 킬레이트화 성능을 특성화하고 이를 구리 결합 펩티드 메탄노박틴과 비교할 수 있는 방법을 보여준다.

Introduction

구리 와 아연 이온은 살아있는 유기체에 필수적이며 산화 보호, 조직 성장, 호흡, 콜레스테롤, 포도당 대사 및 게놈 판독을 포함한 과정에 매우 중요합니다1. 이러한 기능을 활성화하기 위해, Cys의 티오레이트, 그의2,3의imidazole , (더 드물게) 메티오닌의 티오에테르, 글루와 Asp의 카르복실레이트와 같은 그룹은 금속을 활성 부위에 보조 인자로 선택적으로 통합합니다. 금속 효소. 이러한 조정 그룹의 유사성은 그와 Cys 리간드가 올바른 기능을 보장하기 위해 Cu (I / II) 또는 Zn (II)을 선택적으로 통합하는 방법에 관한 흥미로운 질문을 제기합니다.

선택적 결합은 종종 Zn (II) 또는 Cu (I / II) 이온 농도를 제어하는 펩티드를 획득하고 인신 매매하여 수행됩니다4. Cu (I/II)는 반응성이 높고 효소에 산화 손상 또는 모험적 결합을 일으키므로 자유 농도는 구리 보호막과 구리 조절 단백질에 의해 단단히 조절되어 세포의 다양한 위치로 안전하게 운반하고 단단히 운반합니다. 그것의 항상성제어 5,6. 구리 대사 또는 항상성의 중단은 Menkes 및 Wilson의 질병7뿐만 아니라 암7 및 신경 질환, 예컨대 프리온8 및 알츠하이머 병9에직접적으로 연루된다.

윌슨의 질병은 눈의 증가 구리 수준과 관련, 간 및 뇌의 섹션, Cu의 레독스 반응 (I/II) 반응성 산소 종을 생산, 간 장 성 및 신경 변성을 일으키는. 기존 킬레이트 요법은 작은 티올 아미노산 페니실라민과 트리에틸네테트라민입니다. 대안적으로, 메탄영양구리-펩타이드(mb)10,11은 Cu(I)에 대한 그들의 높은 결합 친화도 때문에 치료적 잠재력을나타낸다.12. 메틸로시누스 트리코스포륨 OB3b로부터의 메탄백박틴(mb-OB3b)이 윌슨병의 동물 모델에서 연구되었을 때, 구리는 간에서 효율적으로 제거되고 담즙13을통해 배설되었다. 시험관내 실험에서 mb-OB3b는 간시토졸(13)에함유된 구리 메탈로티오닌으로부터 구리를 킬레이트할 수 있음을 확인하였다. 레이저 절제 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 이미징 기술은 윌슨 병 간 샘플14,15,16에서 구리의 공간 분포를 조사하고 MB-OB3b를 나타내고 있다. 단 8 일17의짧은 처리 기간으로 구리를 제거합니다.

mb-OB3b는 또한 Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) 및 Zn(II)18,19를포함하는 다른 금속 이온과 결합한다. 생리학적 Cu(I) 결합 부위에 대한 경쟁은 Mb-OB3b 복합체로부터 Cu(I)를 대체할 수 있기 때문에 Ag(I)에 의해 전시되며, Ag(I) 및 Ni(II)는 또한 Cu(I)19에의해 변위될 수 없는 MB에 돌이킬 수 없는 결합을 나타낸다. 최근, 2His-2Cys 결합 모티프를 가진 일련의 대체 메탄백액틴(amb) 올리고펩티드가20,21,및 그들의 Zn(II) 및 Cu(I/II) 결합 특성을 특징으로 하는 것으로 연구되었다. 그들의 1 차적인 아미노산 서열은 유사하고, 그들은 모두 2His-2Cys 모티프, 프로 및 아세틸화 된 N-종단을 함유하고 있습니다. 그들은 주로 2His-2Cys 모티프가 mb-OB3b의 두 enethiol 옥사졸론 결합 부위를 대체하기 때문에 mb-OB3b와 주로 다릅니다.

이온 이동성 질량 분석법(ESI-IM-MS)과 결합된 전기 분무 이온화는 질량 대충전(m/z)및 충돌을 측정하기 때문에 펩타이드의 금속 결합 특성을 결정하는 강력한 기법을 제공합니다. 용액 상에서 질량, 전하 및 형태 형상을 보존하면서 단면(CCS)을 m/z 및 CCS는 펩티드 stoichiometry, protonation 상태 및 형태 모양과 관련이 있습니다. Stoichiometry는 종에 존재하는 각 요소의 정체성 그리고 수가 명시적으로 식별되기 때문에 결정됩니다. 펩티드 복합체의 전체 전하는 산성 및 기본 부위의 프로토네이션 상태 및 금속 이온의 산화 상태에 관한 것이다. CCS는 복합체의 삼차 구조와 관련된 회전 평균 크기를 측정하기 때문에 펩타이드 복합체의 형태 형성에 대한 정보를 제공한다. 복합체의 전체 전하 상태는 또한 pH의 기능이며, 카르복실, 그의, Cys 및 Tyr와 같은 탈프로톤화된 기본 또는 산성 부위가 또한 금속 이온에 대한 잠재적 결합 부위이기 때문에 펩티드의 금속 이온 결합 친화도에 영향을 미친다. 분석을 위해 펩타이드 및 금속 이온은 희석 된 아세트산 또는 수산화 암모늄에 의해 조정 된 pH로 수성 용액으로 제조됩니다. 이는 펩티드에 대해 pH 의존성 및 금속 이온 선택성을 결정할 수 있게 한다. 또한 ESI-IM-MS에 의해 결정된 m/z 및 CCS는 B3LYP/LanL2DZ 분자 모델링과 함께 사용하여 복합체의 금속 이온 조정 및 삼차 구조의 유형을 발견할 수 있습니다. 이 문서에 나타난 결과는 ESI-IM-MS가 암펩티드 세트의 선택적 킬레이트화 성능을 특성화하고 이를 구리 결합 펩티드 mb-OB3b와 비교할 수 있는 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 시약의 준비 배양 메틸로시누스 트리코스포륨 OB3b는 Cu(I)-무음 MB-OB3b18,22,23,동결건조시 시료를 동결건조시키고 사용전까지 -80°C에서 보관한다. 앰브 펩티드 (amb;98 % 순도 amb1,amb2,amb4;>70% 순도 amb7)샘플을 동결 건조하고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하십시오. 구매 >9…

Representative Results

Amb1의 금속 결합IM-MS 연구20 amb1 (그림 1A)은구리 와 아연 이온 이온이 모두 pH 의존적 방식으로 amb1에 결합되는 것으로 나타났다(그림2). 그러나, 구리와 아연은 상이한 조정 부위에서 상이한 반응 메커니즘을 통해 amb1에 결합한다. 예를 들어, Cu(II)를 amb1에 첨가하면 이…

Discussion

중요한 단계: ESI-IM-MS를 통한 검사를 위한 솔루션 단계 거동 보존
네이티브 ESI 기악 설정은 펩티드 stoichiometry, 전하 상태 및 형태 구조를 보존하는 데 사용되어야 합니다. 기본 조건의 경우 원뿔 전압, 온도 및 가스 흐름과 같은 ESI 소스의 조건을 최적화해야 합니다. 또한 소스, 트랩, 이온 이동성 및 전송 이동 파(특히 IM 셀로의 사출 전압을 제어하는 DC 트랩 바이어스)의 압력과 전압?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 자료는 1764436, NSF 기기 지원(MRI-0821247), 웰치 재단(T-0014), 에너지부(TX-W-20090427-0004-50) 및 L3 통신의 컴퓨팅 리소스에 따라 국립 과학 재단이 지원하는 작업을 기반으로 합니다. . 우리는 시그마 프로그램과 아요바미 Ilesanmi비디오에서 기술을 시연에 대한 공유 산타 바바라 캘리포니아 대학의 바우어의 그룹에 감사드립니다.

Materials

acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281
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Keywords: Ion Mobility-mass SpectrometryIM-MSMetal Ion RecognitionRedox ActivityMetal Binding OligopeptidesMolecular ModelingTertiary StructureMetal CorrelationESI-IM-MSPoly-DL-alanineAlternative MethanobactinPH-dependent RedoxMethyl Binding ReactionProduct IonsStoichiometryProtonation StateConformational StructureMetal Chelating PeptidesTherapeuticsMenkes DiseaseWilson’s DiseaseCancerAlzheimer’s DiseaseNative ESI-IM-MSNegative IonPositive IonAcetic AcidAmmonium HydroxideMass-to-chargeIsotope Pattern
check_url/kr/60102?article_type=t

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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).
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