Modello chirurgico murine dell'elastasi topica indotta decrescente all'aneurtica toracica
Summary
Descriviamo un protocollo chirurgico per indurre costantemente robusti aneurismi aortici discendenti nei topi. La procedura prevede la toracotomia sinistra, l’esposizione all’aorta toracica e il posizionamento di una spugna imbevuta di elastasi pancreatica porcina sulla parete aortica.
Abstract
Secondo il Center for Disease Control, gli aneurismi aortici (AA) sono stati considerati una delle principali cause di morte in tutte le razze ed entrambi i sessi dal 1999 al 2016. Un aneurisma si forma a seguito di progressivo indebolimento e didilatazione dell’aorta, che può rompersi o strappare una volta raggiunto un diametro critico. Gli aneurismi dell’aorta discendente nel petto, chiamati aneurismi aortici toracici discendenti (dTAA), costituiscono una grande percentuale di casi di aneurisma negli Stati Uniti. La rottura di dTAA non contenuta è quasi universalmente letale e la riparazione elettiva ha un alto tasso di morbilità e mortalità. Lo scopo del nostro modello è quello di studiare la dTAA in modo specifico, chiarire la fisiopatologia della dTAA e cercare obiettivi molecolari per arrestare la crescita o ridurre le dimensioni della dTAA. Avendo un modello murino per studiare con precisione la patologia toracica, è possibile sviluppare terapie mirate per testare specificamente la dAA. Il metodo si basa sul posizionamento dell’elasasi pancreatica dei porcini (PPE) direttamente sulla parete aortica murina esterna dopo l’esposizione chirurgica. Questo crea una reazione distruttiva e infiammatoria, che indebolisce la parete aortica e permette la formazione di aneurisma per settimane o mesi. Anche se i modelli murine possiedono limitazioni, il nostro modello dTAA produce robusti aneurismi di dimensioni prevedibili. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per testare obiettivi genetici e farmaceutici che possono arrestare la crescita della DTAA o prevenire la rottura. Nei pazienti umani, interventi come questi potrebbero aiutare a evitare la rottura dell’aneurisma e un intervento chirurgico difficile.
Introduction
Lo scopo di questo metodo è quello di studiare lo sviluppo, la fisiofisiologia e i cambiamenti strutturali nell’aorta toracica discendente murina durante la formazione di aneurismi aortici. Il nostro modello offre un metodo riproducibile e coerente per indurre aneurismi aortici toracici (dTAA) nei topi consentendo così la verifica di vari inibitori genetici e farmacologici. Questo lavoro può aiutare a identificare i farmaci e le terapie geniche che potrebbero essere tradotte in una strategia di trattamento praticabile per gli esseri umani affetti da malattia di DTAA.
Le DAA si formano quando la parete dell’aorta toracica si indebolisce e si dilata nel tempo fino a raggiungere un diametro critico quando può verificarsi strappo o rottura. Clinicamente, la dTAA può progredire in silenzio, aumentando di dimensioni fino a quando la struttura della parete aortica è così distorta che alla fine fallisce, con conseguenze catastrofiche. Per quanto riguarda, i sintomi di solito si sviluppano solo quando l’aneurisma ha raggiunto una dimensione perilosa (100-150% dilatazione) ed è ad alto rischio di dissezione o rottura1,2. La rottura della dTAA è quasi universalmente letale3, e la riparazione chirurgica elettiva porta una morbilità significativa4,5. Inoltre, la maggior parte dei pazienti portano la diagnosi di un aneurisma aortico per circa 5 anni prima della riparazione chirurgica6,7. Questa finestra rappresenta un momento opportuno per intervenire in modo non chirurgico. Pertanto, sono necessarie terapie mediche per trattare o rallentare la progressione della dTAA e rappresenterebbero un significativo progresso nel campo della ricerca sull’aneurisma. Attualmente non ci sono trattamenti medici per la dTAA, soprattutto a causa di una comprensione incompleta della patogenesi della dTAA.
Negli ultimi 20 anni sono stati sviluppati diversi modelli animali dTAA, ma ciascuno di questi modelli si è distinto dal nostro e non ha prodotto aneurismi robusti. Un modello di dTAA murine più simile al nostro è stato sviluppato da Ikonomidis et al.8, che include l’applicazione diretta di CaCl2 all’avvento dell’aorta. Anche se il nostro modello è stato adattato da molte delle tecniche stabilite da Ikonomidis, il nostro modello è unico in tre modi separati. In primo luogo, nel nostro modello l’aorta è esposta all’elastasi topica per 3-5 minuti, rispetto ai 15 minuti di esposizione a CaCl 2. In secondo luogo, la dilatazione aortica si verifica in 2 settimane, rispetto alle 16 settimane nel modello CaCl 2. Infine, il nostro modello produce costantemente aneurismi di circa il 100% di dilatazione, rispetto alle dilatazioni aortiche del 20-30% prodotte dall’applicazione CaCl2 (che non possono essere realmente considerate aneurismi in quanto definiti come un aumento diametro >50%). Ci sono altri modelli murini non chirurgici della formazione di aneurisma, come il topo Knockout Apo E, che formano robusti aneurismi con infusione di angiotensina II. Tuttavia, questi topi sviluppano aneurismi aortici tonocici o supracici piuttosto che aneurismi specificamente nell’aorta toracica discendente9,10.
Il razionale per questo protocollo è quello di avere un modo semplice, economico, e il tempo adatto per studiare dTAA in un modello murino. Il modello murino offre un’opportunità unica di utilizzare molti knockout genetici e specifici delle cellule che sono stati trovati per essere di impatto in altre malattie vascolari. L’uso del nostro specifico modello TAA è stato ben accolto e gli esperimenti che lo utilizzano sono stati pubblicati su riviste ad alto impatto11,12. A questo punto, il modello è stato utilizzato per studiare possibili trattamenti genetici e farmacologici che hanno avuto un effetto significativo nei modelli murini addominali anortici (AAA); tuttavia, poiché il nostro laboratorio ha ampliato l’uso del modello dTAA, stiamo trovando obiettivi unici per la formazione di dTAA che potrebbero essere utilizzati come terapie mirate negli esseri umani.
Questo modello è più appropriato per i laboratori che hanno capacità micro-chirurgiche murine. Anche se è tecnicamente impegnativo, può essere eseguito in modo coerente anche dai ricercatori senza alcuna esperienza chirurgica precedente. Per un ricercatore senza alcuna esperienza chirurgica murina il modello può essere masterizzato in circa 20 sessioni operative (o circa 50 topi). Per il ricercatore con esperienza chirurgica precedente, il modello può essere masterizzato in 5 sessioni operative (circa 20 topi). Crediamo che con un video di alta qualità, il tempo di padronanza può essere ulteriormente ridotto. Dopo la conoscenza, la procedura può essere completata in 35 minuti per l’intervento chirurgico e 20 minuti per la raccolta terminale. I chirurghi del nostro laboratorio possono completare 10-12 interventi chirurgici completi al giorno, con un tasso di mortalità operativa del 5-10%. La causa più comune di mortalità è la lesione polmonare all’ingresso al torace, la tossicità anestetica o lo strappo dell’aorta durante la dissezione. Oltre alla ricerca dTAA, questo modello serve anche come guida per un accesso facile e sicuro all’aorta toracico e al barile polmonare per i ricercatori che studiano altri interventi nel torace.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le aorta toraciche e addominali sono cellularalmente ed embrionalmente distinte, che è rilevante per la malattia aneurismica14,15,16. Pertanto, è necessario un modello animale specifico per studiare la TAA. Anche se altri modelli murine dTAA sono stati pubblicati8, il nostro è l’unico modello per creare dilatazione aortica toracica discendente che può essere considerata veramente aneurismatica (oltre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni AHA Scientist Development Grant 14SDG187300000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) e RO1 HL081629 (G.R.U.). Questo progetto è stato sostenuto dalla Thoracic Surgery Foundation for Research and Education (TSFRE) Research Grant (PI: G. Ailawadi). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni della NHLBI o del TSFRE. Ringraziamo Anthony Herring e Cindy Dodson per le loro conoscenze e competenze tecniche.
Materials
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
