Summary

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Abstract

Der neuroinflammatorische Zustand des Zentralnervensystems (ZNS) spielt bei physiologischen und pathologischen Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn und manchmal die infiltrierenden Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs), regulieren das entzündungshemmende Profil ihrer Mikroumgebung im ZNS. Es wird nun akzeptiert, dass die extrazellulären Vesikelpopulationen (EV) aus Immunzellen als Immunmediatoren fungieren. Daher sind ihre Sammlung und Isolierung wichtig, um ihren Inhalt zu identifizieren, aber auch ihre biologischen Auswirkungen auf Empfängerzellen zu bewerten. Die vorliegenden Daten heben die chronologischen Anforderungen an die EV-Isolierung von Mikrogliazellen oder Blutmakrophagen hervor, einschließlich der Schritte zur Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC). Eine nicht zielgerichtete proteomische Analyse ermöglichte die Validierung von Proteinsignaturen als EV-Marker und charakterisierte den biologisch aktiven EV-Gehalt. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auch funktionell auf der Primärkultur von Neuronen verwendet, um ihre Bedeutung als Immunmediatoren im Neuritenwachstum zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge dazu beitragen, das Neuritenwachstum in vitro zu erleichtern. Parallel dazu wurden von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge funktionell als Immunmediatoren in Sphäroidkulturen von C6-Gliomzellen eingesetzt, die Ergebnisse zeigten, dass diese EVs die Gliomzellinvasion in vitro kontrollieren. Dieser Bericht hebt die Möglichkeit hervor, die EV-vermittelten Immunzellfunktionen zu bewerten, aber auch die molekularen Grundlagen einer solchen Kommunikation zu verstehen. Diese Entschlüsselung könnte die Verwendung natürlicher Vesikel und/oder die In-vitro-Vorbereitung von therapeutischen Vesikeln fördern, um Immuneigenschaften in der Mikroumgebung von ZNS-Pathologien nachzuahmen.

Introduction

Viele Neuropathologien stehen im Zusammenhang mit dem neuro-inflammatorischen Zustand, der ein komplexer Mechanismus ist, der zunehmend in Betracht gezogen wird, aber immer noch schlecht verstanden wird, weil die Immunprozesse vielfältig sind und von der Zellumgebung abhängen. Tatsächlich beinhalten die ZNS-Erkrankungen nicht systematisch die gleichen Aktivierungssignale und Immunzellpopulationen, so dass die pro- oder entzündungshemmenden Reaktionen als Ursachen oder Folgen von Pathologien schwer zu bewerten sind. Die hirnresidenten Makrophagen, die als “Mikroglia” bezeichnet werden, scheinen an der Schnittstelle zwischen Nerven- und Immunsystem zu sein1. Mikroglia haben einen myeloischen Ursprung und werden aus dem Dottersack während der primitiven Hämatopoese abgeleitet, um das Gehirn zu kolonisieren, während periphere Makrophagen von der fetalen Leber während der definitiven Hämatopoese abgeleitet werden, um periphere Makrophagen zu werden2. Die Mikrogliazellen kommunizieren mit Neuronen und neuronabgeleiteten Gliazellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten3. Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass Mikroglia an neuronaler Plastizität während der ZNS-Entwicklung und der Homöostase von Erwachsenengewebe beteiligt ist, und auch im entzündlichen Zustand, der mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist4,5. Andernfalls kann die Integrität der Blut-Hirn-Schranke in anderen ZNS-Pathologien beeinträchtigt werden. Die Immunantworten, insbesondere bei Glioblastom-Multiforme-Krebs, werden nicht nur von Mikroglia-Zellen unterstützt, da die Blut-Hirn-Schranke durch angiogene Prozesse und das Vorhandensein von Lymphgefäßen6,7reorganisiert wird. Daher tritt eine große Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) Infiltration im Hirntumor durch tumorabhängige Angiogenesemechanismen8auf. Die Krebszellen üben einen signifikanten Einfluss auf infiltrierte BMDMs aus, was zu immunsuppressiven Eigenschaften und Tumorwachstum9führt. So ist die Kommunikation zwischen den Immunzellen und ihrer Gehirnmikroumgebung schwer zu verstehen, da der Zellursprung und die Aktivierungssignale unterschiedlich sind10,11. Es ist daher interessant, die Funktionen immunzellassoziierter molekularer Signaturen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. In diesem Zusammenhang kann die Zell-Zell-Kommunikation zwischen Immunzellen und Zellmikroumgebung durch die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) untersucht werden.

Die Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr in der Regulierung von Immunfunktionen unter gesunden sowie pathologischen Bedingungen untersucht12,13. Zwei Populationen, Exosomen und Mikrovesiken, können berücksichtigt werden. Sie präsentieren unterschiedliche Biogenese und Größenbereiche. Die Exosomen sind Vesikel von 30 bis 150 nm Durchmesser und werden aus dem endosomalen System erzeugt und bei der Fusion von multivesicularen Körpern (MVBs) mit der Plasmamembran abgesondert. Die Mikrovesiken haben einen Durchmesser von etwa 100–1.000 nm und werden durch einen nach außen gerichteten Aufblühen aus der Zellplasmamembran14erzeugt. Da die Exosome n.A.-Mikrovesik-Diskriminierung je nach Größe und molekularen Mustern immer noch schwer zu realisieren ist, werden wir im vorliegenden Bericht nur den Begriff Elektrofahrzeuge verwenden. Die EV-assoziierte Kommunikation im ZNS stellt einen Ahnenmechanismus dar, da Studien ihre Beteiligung an wirbellosen Arten wie Nematoden, Insekten oder Anneliden15,16zeigten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, die zeigen, dass Elektrofahrzeuge mit Zellen verschiedener Arten kommunizieren können, diesen Mechanismus als Schlüsselschlosssystem, das zunächst auf der Oberflächenmolekülerkennung zwischen Vesikeln und Empfängerzellen basiert und dann die Aufnahme von Mediatoren16,17ermöglicht. Tatsächlich enthalten die Elektrofahrzeuge viele Moleküle wie Proteine (z. B. Enzyme, Signaltransduktion, Biogenesefaktor), Lipide (z. B. Ceramid, Cholesterin) oder Nukleinsäuren (z. B. DNA, mRNA oder miRNAs), die als direkte oder indirekte Regulatoren der Empfängerzellaktivitäten14wirken. Deshalb wurden auch methodische Studien an Immunzellen durchgeführt, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und ihre Proteinsignaturen vollständig zu charakterisieren18,19.

Die frühesten Studien zeigten die Freisetzung von Exosomen aus primär kultivierter Rattenmikroglia als induzierbaren Mechanismus nach einer Wnt3a- oder Serotonin-abhängigen Aktivierung20,21. Funktionell im ZNS regulieren mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge die synaptische Vesikelfreisetzung durch präsynaptische Terminals in Neuronen, die zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit beitragen22,23. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge könnten auch Zytokine-vermittelte Entzündungsreaktionen in großen Hirnregionen24,25vermehren. Wichtig ist, dass die verschiedenen Liganden für die gebührenähnliche Rezeptorfamilie bestimmte Produktionen von Elektrofahrzeugen in der Mikroglia26aktivieren könnten. Beispielsweise zeigen In-vitro-Studien, dass LPS-aktivierte Mikroglia BV2-Zelllinien differenzielle EV-Gehalte einschließlich pro-inflammatorische Zytokineproduzieren 27. Daher könnte die funktionelle Vielfalt von Immunzellsubpopulationen in den ZNS-, Mikroglia- und infiltrierenden BMDMs durch ihre eigenen EV-Populationen bewertet werden, einschließlich der Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen und der Identifizierung von EV-Inhalten.

Wir haben zuvor Methoden beschrieben, um die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia- und BMDM-abgeleiteten Elektrofahrzeugen nach deren Isolierung zu bewerten16,19. Im vorliegenden Bericht schlagen wir vor, die Wirkung von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf das Neuritenwachstum und die Wirkung von makrophageabgeleiteten Elektrofahrzeugen auf die Kontrolle von Gliomzellaggregaten unabhängig zu bewerten. Diese Studie schlägt auch eine breit angelegte proteomische Analyse der EV-Fraktionen vor, um das EV-Isolationsverfahren zu validieren und die biologisch aktiven Proteinsignaturen zu identifizieren. Die wohltuende Wirkung und die molekulare Entschlüsselung von EEV-Inhalten könnten ihnen helfen, sie zu manipulieren und als therapeutische Mittel bei Hirnerkrankungen zu verwenden.

Protocol

1. Primärkultur von Mikroglia/Makrophagen Primärkultur der Mikroglia Kultur kommerzielle Ratte primäre Mikroglia (2 x 106 Zellen) (siehe Tabelle der Materialien) in Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% exosomenfreies Serum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 9,0 g/L Glukose bei 37 °C und 5% CO2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 48-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Ele…

Representative Results

Eine der größten Herausforderungen bei der Zuordnung von bioulären Vesikeln (EVs) ist die Fähigkeit, die Elektrofahrzeuge vom gesamten Kulturmedium zu isolieren. In diesem Bericht stellen wir eine Methode mit Ultrazentrifugation (UC) und Größenausschlusschromatographie (SEC) vor, die an die groß angelegte Analyse von Proteinsignaturen gekoppelt ist, um EV-Marker zu validieren und bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Die makrophagen- oder mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeuge wurden nach einer 24-h- bzw. 48-…

Discussion

Das zentralnervöse System (ZNS) ist ein komplexes Gewebe, in dem die Zell-zu-Zell-Kommunikation normale neuronale Funktionen reguliert, die für die Homöostase30notwendig sind. Elektrofahrzeuge werden heute weithin untersucht und als wichtige molekulare Ladungen für die Zell-zu-Zell-Kommunikation beschrieben31. Sie liefern speziell einen Cocktail von Mediatoren an Empfängerzellen und beeinflussen so ihre Funktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die vorgestellte Arbeit wurde von der Ministére de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche und INSERM unterstützt. Wir danken der BICeL- Campus Scientific City Facility für den Zugang zu Instrumenten und technischen Ratschlägen. Wir danken Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard und Isabelle Fournier für die Unterstützung der Massenspektrometrie. Wir danken Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli und Pierre-Eric Sautiére für ihren starken Beitrag zu den wissenschaftlichen und technischen Entwicklungen.

Materials

12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2X Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10X Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

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Cite This Article
Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

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