Summary

Характеристика экстраклеточных пузырьков, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального воздействия на клеточную среду

Published: June 02, 2020
doi:

Summary

В настоящем докладе освещаются хронологические требования к внеклеточной изоляции везикулы (EV) от микроглии или макрофагов крови. Микроглии полученных EVs были оценены как регуляторы неврит нарастания в то время как кровь макрофаг полученных EVs были изучены в контроле C6 глиомы ячейки вторжения в пробирке анализов. Цель состоит в том, чтобы лучше понять эти функции EV в качестве иммунных посредников в конкретных микросредах.

Abstract

Нейровоспалительное состояние центральной нервной системы (ЦНС) играет ключевую роль в физиологических и патологических состояниях. Микроглия, резидентиммунные клетки в головном мозге, а иногда и проникновение макрофагов из костного мозга (BMDMs), регулируют воспалительный профиль их микроокружения в ЦНС. В настоящее время принято, что внеклеточные везикулы (EV) популяций из иммунных клеток выступают в качестве иммунных посредников. Таким образом, их сбор и изоляция имеют важное значение для определения их содержания, но и для оценки их биологического воздействия на клетки-реципиента. В настоящее время данные подчеркивают хронологические требования к изоляции EV от клеток микроглии или макрофагов крови, включая ультрацентрифугацию и хроматографию размеров (SEC). Нецелевой протеомный анализ позволил валидации белковых подписей в качестве маркеров EV и охарактеризовал биологически активное содержание EV. Микроглии полученных EVs были также функционально использованы на первичной культуре нейронов, чтобы оценить их важность в качестве иммунных посредников в неврит роста. Результаты показали, что микроглии полученных EVs способствовать облегчению неврита рост в пробирке. Параллельно, кровь макрофагов полученных EVs были функционально использованы в качестве иммунных посредников в сфероидных культур клеток глиомы C6, результаты, показывающие, что эти ЭВ контролировать вторжение глиомы клеток в пробирке. В настоящем докладе подчеркивается возможность оценки функций иммунных клеток, опосредованных ЕВ, а также понимания молекулярных основ такой связи. Это расшифровка может способствовать использованию природных пузырьков и/или экстракорпорного приготовления терапевтических пузырьков для имитации иммунных свойств в микроокружении патологий ЦНС.

Introduction

Многие нейропатологии связаны с нейровоспалительным состоянием, которое является сложным механизмом, который все чаще рассматривается, но все еще плохо понимается, потому что иммунные процессы разнообразны и зависят от клеточной среды. Действительно, расстройства ЦНС систематически не связаны с теми же сигналами активации и популяциями иммунных клеток, и, таким образом, про- или противовоспалительные реакции трудно оценить как причины или последствия патологий. Мозг резидентов макрофаги называется “микроглии”, как представляется, на стыке нервной и иммуннойсистемы 1. Микроглия имеют миелоидное происхождение и являются производными от желток мешок во время примитивных hematopoiesis колонизировать мозг, в то время как периферийные макрофаги являются производными от печени плода во время окончательного hematopoiesis стать периферийных макрофагов2. Клетки микроглии общаются с нейронами и нейронами, полученными глиальными клетками, такими как астроциты и олигодендроциты3. Несколько недавних исследований показали, что микроглии участвуют в нейронной пластичности во время развития ЦНС и взрослых тканей гомеостаза, а также в воспалительном состоянии, связанном с нейродегенеративными заболеваниями4,5. В противном случае, целостность гематоэнцефалического барьера может быть нарушена в других патологиях ЦНС. Иммунные реакции, особенно при мультиформе рака глиобластомы, не поддерживаются только клетками микроглии, так как гематоэнцефалический барьер реорганизуется через ангиогенные процессы и наличие лимфатических сосудов6,,7. Таким образом, большой костного мозга полученных макрофагов (BMDMs) инфильтрация происходит в опухоли головного мозга через опухолевых механизмов ангиогенеза8. Раковые клетки оказывают значительное влияние на проникнутые БМДМ, что приводит к иммуносупрессивным свойствам и росту опухоли9. Таким образом, связь между иммунными клетками и их микроокружения мозга трудно понять, как происхождение клеток и активации сигналы разнообразны10,11. Таким образом, интересно задержать функции иммунных клеток, связанных молекулярных подписей в физиологических условиях. В связи с этим, клеточная связь между иммунными клетками и микроокружением клеток может быть изучена путем высвобождения внеклеточных пузырьков (ЭВ).

EVs изучаются все больше и больше в регуляции иммунных функций в здоровых, а также патологических условиях12,13. Можно принимать во внимание две популяции, экзосомы и микровезички. Они представляют различные биогенеза и диапазоны размеров. Экзосомы представляют собой пузырьки диаметром от 30 до 150 нм и генерируются из эндозомальной системы и выделяются при слиянии многопузырьковых тел (МВБ) с плазменной мембраной. Микровезики около 100-1000 нм в диаметре и генерируются внешним почками из мембраны плазмы клетки14. Поскольку экзосома против микровесикла дискриминации по-прежнему трудно реализовать в соответствии с размером и молекулярными моделями, мы будем использовать только термин EVs в настоящем докладе. EV-ассоциированных связи в ЦНС представляет собой механизм предков, поскольку исследования показали их участие в беспозвоночных видов, включая нематод, насекомых или аннелид15,16. Кроме того, результаты, показывающие, что EVs может общаться с клетками из разных видов, демонстрируют этот механизм, чтобы быть системой блокировки ключей, основанной сначала на распознавании поверхностных молекул между пузырьками и клетками-реципиентами, а затем позволяющим поглощению посредников16,17. Действительно, EVs содержат много молекул, как белки (например, ферменты, трансдукция сигнала, биогенез фактор), липиды (например, керамид, холестерин) или нуклеиновых кислот (например, ДНК, мРНК или miRNAs), действующих в качестве прямых или косвенных регуляторов деятельности клеток-реципиентов14. Именно поэтому были проведены методические исследования на иммунных клетках для изоляции ЭВ и полной характеристики их белковых подписей18,19.

Самые ранние исследования продемонстрировали высвобождение экзосом из первичной культивируемой крысиной микроглии в качестве индуцируемого механизма после wnt3a- или серотонина-зависимой активации20,21. Функционально в ЦНС, микроглии полученных EVs регулируют синаптический везикул релиз пресинаптических терминалов в нейронах, способствующих контролю возбудимости нейронов22,23. Микроглии полученных EVs может также размножаться цитокинов опосредошной воспалительной реакции в больших областях мозга24,25. Важно отметить, что разнообразные лиганды для платных рецепторов семьи может активировать конкретные производства EVs в микроглии26. Например, исследования in vitro показывают, что LPS-активированные микроглии BV2 клеточные линии производят дифференциальное содержание EV, включая провоспалительные цитокины27. Таким образом, функциональное разнообразие субпопуляций иммунных клеток в ЦНС, микроглии и проникновения BMDMs, могут быть оценены через свои собственные популяции EV, включая воздействие EV на клетки-реципиента и идентификации содержимого EV.

Ранее мы описали методы оценки функциональных свойств микроглии и БМДМ полученных EVs после их изоляции16,19. В настоящем докладе мы предлагаем самостоятельно оценить влияние микроглий полученных ЭВ на невритный рост, а также влияние эвакуированных макрофагов на контроль агрегатов клеток глиомы. Это исследование также предлагает широкий протеомный анализ фракций EV для того, чтобы проверить процедуру изоляции EV, а также определить биологически активные подписи белка. Благотворное воздействие и молекулярной расшифровки содержимого EV может помочь их возможные манипуляции и использования в качестве терапевтических агентов в расстройства мозга.

Protocol

1. Первичная культура микроглии/макрофагов Первичная культура микроглии Культура коммерческих крыс первичной микроглии (2 х 106 клеток) (см. Таблица материалов) в Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) дополнены 10% экзосомы свободной сыворотки, 100 U /mL пени…

Representative Results

Одной из основных проблем, связанных с приписыванием биологических эффектов внеклеточным пузырьками (ЭВ), является способность изолировать ЭВ от всей среды культуры. В этом отчете мы представляем метод с использованием ультрацентрифюгации (UC) и хроматографии для исключения размера (SEC…

Discussion

Центральная нервная система (ЦНС) представляет собой сложную ткань, в которой связь от клеток к клетке регулирует нормальные нейронные функции, необходимые для гомеостаза30. EVs в настоящее время широко изучены и описаны как важные молекулярные грузы для клеточной связи<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Представленная работа была поддержана Национальным министерством образования, де Л’Энсеньмент-Супьерии и ИНСЕРМ. Мы с благодарностью отмечаем BICeL- Кампус Научный городской фонд за доступ к инструментам и техническим консультациям. Мы с благодарностью признательны за помощь в масс-спектрометрии, в которой были с благодарностью юан-Паскаль Химено, Сулейман Абулуар и Изабель Фурнье. Мы с благодарностью признательны Танине Араб, Кристель ван Камп, Франсуазе ле Мартрек-Крок, Якопо Визиоли и Пьеру-Эрику Сотьеру за их значительный вклад в научно-технические разработки.

Materials

12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2X Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10X Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -. N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -. M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -. M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Play Video

Cite This Article
Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

View Video