Caratterizzazione delle vescicoli extracellulari derivati dalle cellule immunitarie e studio dell'impatto funzionale sull'ambiente cellulare
Summary
La presente relazione evidenzia i requisiti cronologici per l’isolamento delle vesciche extracellulari (EV) da microglia o macrofagi di sangue. Gli EV derivati dalla microglia sono stati valutati come regolatori dell’escrescenza di neurite, mentre gli EV derivati dai macrofaci di sangue sono stati studiati nel controllo dell’invasione delle cellule glioma C6 nei saggi in vitro. L’obiettivo è comprendere meglio queste funzioni EV come mediatori immunitari in microambienti specifici.
Abstract
Lo stato neuroinfiammatorio del sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo chiave nelle condizioni fisiologiche e patologiche. La microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, e talvolta i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMSDM), regolano il profilo infiammatorio del loro microambiente nel SNC. Ora è accettato che le popolazioni di vescicoli extracellulari (EV) provenienti da cellule immunitarie agiscano come mediatori immunitari. Pertanto, la loro raccolta e isolamento sono importanti per identificare il loro contenuto, ma anche valutare i loro effetti biologici sulle cellule riceventi. I dati attuali evidenziano i requisiti cronologici per l’isolamento degli EV dalle cellule della microglia o dai macrofagi del sangue, compresi i passi di ultracentrifugazione e cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC). Un’analisi proteomica non mirata ha permesso la convalida delle firme delle proteine come marcatori EV e ha caratterizzato il contenuto di EV biologicamente attivo. Gli EV derivati dalla microglia sono stati utilizzati anche funzionalmente sulla coltura primaria dei neuroni per valutarne l’importanza come mediatori immunitari nella escrescenza di neurite. I risultati hanno mostrato che i veicoli elettrici derivati dalla microglia contribuiscono a facilitare la escrescenza di neurite in vitro. Parallelamente, gli EV derivati dai macrofaci del sangue sono stati usati funzionalmente come mediatori immunitari nelle colture sferoidi delle cellule glioma C6, i risultati mostrano che questi EV controllano l’invasione delle cellule glioma in vitro. La presente relazione evidenzia la possibilità di valutare le funzioni delle cellule immunitarie mediate da EV, ma anche di comprendere le basi molecolari di tale comunicazione. Questa decifrazione potrebbe promuovere l’uso di vesciche naturali e/o la preparazione in vitro di vescicoli terapeutici al fine di imitare le proprietà immunitarie nel microambiente delle patologie del SNC.
Introduction
Molte neuropatologie sono legate allo stato neuroinfiammatorio che è un meccanismo complesso che è sempre più considerato, ma ancora poco compreso perché i processi immunitari sono diversi e dipendono dall’ambiente cellulare. Infatti, i disturbi del SNC non comportano sistematicamente gli stessi segnali di attivazione e le stesse popolazioni di cellule immunitarie e quindi le risposte pro o antinfiammatorie sono difficili da valutare come cause o conseguenze delle patologie. I macrofagi residenti nel cervello chiamati “microglia” sembrano essere all’interfaccia tra il sistema nervoso e il sistema immunitario1. La microglia ha un’origine mieloide e deriva dal sacco di tuorlo durante l’ematopoiesi primitiva per colonizzare il cervello, mentre i macrofagi periferici sono derivati dal fegato fetale durante l’ematopoiesi definitiva per diventare macrofagi periferici2. Le cellule di microglia comunicano con neuroni e cellule gliali derivate da neuroni come astrociti e oligodendrociti3. Diversi studi recenti hanno dimostrato che le microglia sono coinvolte nella plasticità neuronale durante lo sviluppo del SNC e l’omeostasi del tessuto adulto, e anche nello stato infiammatorio associato alle malattie neurodegenerative4,5. In caso contrario, l’integrità della barriera ematoence-encefalica può essere compromessa in altre patologie CNS. Le risposte immunitarie, soprattutto nel cancro del glioblastoma multiforme, non sono supportate solo dalle microglia come la barriera elica viene riorganizzata attraverso processi angiogenici e la presenza di vasi linfatici6,7. Pertanto, un’infiltrazione di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) si verifica nel tumore cerebrale durante i meccanismi di angiogenesi dipendenti dal tumore8. Le cellule tumorali esercitano un’influenza significativa sui BMM infiltrati che portano alle proprietà immunosoppressive e alla crescita del tumore9. Così la comunicazione tra le cellule immunitarie e il loro microambiente cerebrale è difficile da capire in quanto l’origine cellulare e i segnali di attivazione sono diversi10,11. È quindi interessante comprendere le funzioni delle firme molecolari associate alle cellule immunitarie in condizioni fisiologiche. A questo proposito, la comunicazione cellule-cellule tra cellule immunitarie e microambiente cellulare può essere studiata attraverso il rilascio di vesciche extracellulari (EV).
I VE sono sempre più studiati nella regolazione delle funzioni immunitarie in condizioni sane e patologiche12,13. Due popolazioni, esosomi e microvescicoli, possono essere prese in considerazione. Presentano diverse biogenesi e gamme di dimensioni. Gli esosomi sono vesciche di diametro compreso tra 30 e 150 nm e sono generati dal sistema endosomico e secreti durante la fusione di corpi multivessicolari (MVB) con la membrana plasmatica. I microvescicoli hanno un diametro di circa 100-1.000 nm e sono generati da un germogliamento esteriore dalla membrana plasmatica cellulare14. Poiché la discriminazione esosoma contro microvescicolo è ancora difficile da realizzare in base alle dimensioni e ai modelli molecolari, useremo solo il termine EV nella presente relazione. La comunicazione associata a EV nel SNC rappresenta un meccanismo ancestrale poiché gli studi hanno mostrato il loro coinvolgimento nelle specie invertebrate tra cui nematodi, insetti o annelidi15,16. Inoltre, i risultati che mostrano che i veicoli elettrici possono comunicare con cellule di diverse specie dimostrano che questo meccanismo è un sistema di blocco a chiave, basato prima sul riconoscimento superficie-molecola tra vescicoli e cellule riceventi e quindi consentendo l’assorbimento di mediatori16,17. Infatti, gli EVi contengono molte molecole come proteine (ad esempio, enzimi, trasduzione del segnale, fattore biogenesi), lipidi (ad esempio, ceramide, colesterolo) o acidi nucleici (ad esempio DNA, mRNA o miRNA) che agiscono come regolatori diretti o indiretti delle attività delle cellule riceventi14. Ecco perché sono stati effettuati studi metodologici anche sulle cellule immunitarie per isolare i veicoli elettrici e caratterizzare completamente le loro firme proteiche18,19.
I primi studi hanno dimostrato il rilascio di esosomi dalla microglia primaria di ratti coltivati come meccanismo inducibile dopo un’attivazione Wnt3a- o serotonina-dipendente20,21. Funzionalmente nel SNC, gli EV derivati dalla microglia regolano il rilascio di vesciboli era sinaptiche da terminali pressinaptici nei neuroni che contribuiscono al controllo dell’eccitabilità neuronale22,23. Gli EV derivati dalla microglia potrebbero anche propagare la risposta infiammatoria mediata da citochine nelle grandi regioni cerebrali24,25. È importante sottolineare che i diversi ligandi per la famiglia di recettori a pedaggio potrebbero attivare produzioni specifiche di veicoli elettrici nella microglia26. Ad esempio, studi in vitro mostrano che le linee cellulari microglia BV2 attivate da LPS producono contenuti EV differenziali, tra cui citochine pro-infiammatorie27. Pertanto, la diversità funzionale delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nel SNC, nella microglia e nell’infiltrazione di BMM, potrebbe essere valutata attraverso le proprie popolazioni di EV, tra cui l’impatto EV sulle cellule riceventi e l’identificazione del contenuto di EV.
In precedenza abbiamo descritto metodi per valutare le proprietà funzionali degli EV derivati da microglia e BMDM dopo il loro isolamento16,19. Nella presente relazione, proponiamo di valutare in modo indipendente l’effetto dei veicoli elettrici derivati dalla microglia sull’escrescenza dei neuriti e l’effetto dei VE derivati dai macrofaci sul controllo degli aggregati cellulari del glioma. Questo studio propone anche un’ampia analisi proteomica delle frazioni EV al fine di convalidare la procedura di isolamento EV e identificare le firme proteiche biologicamente attive. Gli effetti benefici e la decifrazione molecolare del contenuto di EV potrebbero aiutare la loro possibile manipolazione e uso come agenti terapeutici nei disturbi cerebrali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema nervoso centrale (CNS) è un tessuto complesso in cui la comunicazione da cellula a cellula regola le normali funzioni neuronali necessarie per l’omeostasi30. I veicoli elettrici sono ora ampiamente studiati e descritti come importanti carichi molecolari per la comunicazione da cellula a cellula31. Essi forniscono specificamente un cocktail di mediatori alle cellule dei destinatari influenzando così le loro funzioni in condizioni sane e patologiche<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro presentato è stato sostenuto dalla Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Ringraziamo con gratitudine lo strumento BICeL- Campus Scientific City per l’accesso a strumenti e consigli tecnici. Ringraziamo jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier per l’assistenza alla spettrometria di massa. Ringraziamo con gratitudine Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière per il loro forte contributo agli sviluppi scientifici e tecnici.
Materials
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
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