면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구
Summary
본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.
Abstract
중추 신경계 (CNS)의 신경 염증 상태는 생리적 및 병리학적 조건에서 중요한 역할을합니다. Microglia, 뇌에 상주 면역 세포, 때로는 침투 골수 파생 대 식 세포 (BMDMs), CNS에서 그들의 미세 환경의 염증 성 프로필을 조절. 면역 세포에서 세포 외 소포 (EV) 인구가 면역 중재자로 작동한다는 것은 지금 받아들여집니다. 따라서, 그들의 수집 및 격리는 그들의 내용을 확인 하지만 또한 받는 사람 세포에 그들의 생물학적 효과 평가 하는 것이 중요 하다. 현재 데이터는 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계를 포함한 미세글리아 세포 또는 혈액 대식세포로부터의 EV 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. 비표적 프로테오믹 분석은 EV 마커로서 단백질 시그니처의 유효성을 검증하고 생물학적 활성 EV 함량을 특징으로 합니다. Microglia 유래 EV는 또한 신경세포의 1차 배양에 기능적으로 사용되어 뉴라이트 의 면역 매체로서의 중요성을 평가했습니다. 결과는 마이크로글리아 유래 전기 자동차체가 시험관 내에서 신경이염 의 자생을 촉진하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 병행하여, 혈액 대식세포 유래 EV는 C6 신경교종 세포의 스페로이드 배양물에서 면역 매개체로서 기능적으로 사용되었고, 이들 EV가 시험관내 신경교종 세포 침범을 제어한다는 것을 보여주는 결과. 이 보고는 EV 매개면역 세포 기능을 평가하는 가능성을 강조하지만 또한 그러한 통신의 분자 기지를 이해합니다. 이 해독은 CNS 병리학의 미세 환경에서 면역 특성을 모방하기 위해 천연 소포 및 / 또는 치료 소포의 시험관 내 준비의 사용을 촉진 할 수 있습니다.
Introduction
많은 신경병학은 점점 더 고려되는 복잡한 기계장치인 신경 선동적인 상태와 관련있습니다, 그러나 면역 프로세스가 다양하고 세포 환경에 달려 있기 때문에 아직도 제대로 이해되지 않습니다. 실제로, CNS 무질서는 체계적으로 동일 활성화 신호 및 면역 세포 인구를 관련시키지 않으며 따라서 프로-또는 항염증 반응은 병리학의 원인 또는 결과로 평가하기 어렵습니다. “microglia”라고 불리는 뇌 상주 대식세포는 신경과 면역 계통 사이의 인터페이스에 있는 것처럼 보입니다1. 미세글리아는 골수성 기원을 가지며 원시 조혈 동안 노른자 낭으로부터 유래되어 뇌를 식민지화하는 반면, 말초 대식세포는 말초 대식세포가 되기 위한 확실한 조혈 동안 태아 간에서 유래된다2. 마이크로글리아 세포는 성상세포 및 올리고엔드로시트와 같은 뉴런 및 뉴런 유래 신경교세포와 통신한다3. 최근 몇 차례의 연구는 마이크로글리아가 CNS 발달 및 성인 조직 항상성 동안 신경성 가소성에 관여하고 있으며, 또한 신경퇴행성 질환과 관련된 염증 성 상태에서4,,5. 그렇지 않으면, 혈액 뇌 장벽의 무결성 다른 CNS 병 리에서 손상 될 수 있습니다. 면역 반응, 특히 교모세포종 다형성암에서, 혈관신생 과정과 림프혈관의 존재를 통해 혈액 뇌 장벽이 재구성됨에 따라 미세글리아 세포에 의해서만 지원되지 않는다6,,7. 따라서, 큰 골수 유래 대식세포(BMDMs) 침윤은 종양 의존성 혈관신생 기전 전반에 걸쳐 뇌종양에서 발생한다8. 암세포는 면역억제성질 및 종양성장으로 이어지는 침투된 BMDM에 상당한 영향을 미친다9. 따라서 면역세포와 이들의 뇌 미세환경 간의 통신은 세포 기원 및 활성화 신호가 다양함에 따라 이해하기 어렵다10,,11. 생리적 조건에서 면역 세포 관련 분자 서명의 기능을 체포 하는 이렇게 재미 있다. 이와 관련하여, 면역 세포와 세포 미세환경 사이의 세포-세포 통신은 세포외 소포(EV)의 방출을 통해 연구될 수 있다.
전기자동차는 병리학적 조건뿐만 아니라 건강한 면역기능의 조절에서 점점 더 많이 연구되고 있다12,,13. 엑소좀과 마이크로베시클 2마리를 고려할 수 있습니다. 그(것)들은 다른 생물학 및 크기 범위를 제출합니다. 엑소좀은 ~ 30-150 nm 직경의 소포이며 내분계에서 생성되고 혈장 막과 다기관 (MVBs)의 융합 동안 분비됩니다. 상기 마이크로베식은 직경이 약 100-1,000 nm이고세포혈장막(14)으로부터바깥쪽으로 신진하여 생성된다. 엑소좀 대 마이크로비시클 의 차별은 크기와 분자 패턴에 따라 실현하기 어렵기 때문에 본 보고서에서는 EV라는 용어만 사용할 것입니다. CNS에 있는 EV 관련 커뮤니케이션은 선충, 곤충 또는 annelids15,,16를포함하여 무척추 동물 종에 그들의 관여를 보여주었기 때문에 조상 기계장치를 나타냅니다. 더욱이, 전기자동차가 상이종의 세포와 통신할 수 있다는 것을 보여주는 결과는 소포와 수용자 세포 사이의 표면 분자 인식에 기초한 키-잠금 시스템으로 이 메커니즘을 입증한 다음, 매개체16,,17의섭취를 허용한다. 실제로, EV는 단백질(예를 들어, 효소, 신호 전달, 생물발생 인자), 지질(예를 들어, 세라미드, 콜레스테롤) 또는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 miRNAs)과 같은 많은 분자를 함유하고 있어 수용자 세포 활동의 직간접적 조절제로서 작용한다14. 이것이 바로 이 유도론적 연구가 또한 면역 세포에서 수행되어 전기자동차를 분리하고 그들의 단백질 시그니처를 완전히 특성화하는18,,19.
초기 연구는 Wnt3a-또는 세로토닌 의존성 활성화20,,21에따른 유도성 메커니즘으로서 1차 배양된 쥐 마이크로글리아로부터 엑소좀의 방출을 입증했다. 기능적으로 CNS에서, 마이크로글리아 유래 EV는 뉴런 의 흥분성의 제어에 기여하는 뉴런에서 시냅스 말단에 의해 시냅스 소포방출을 조절한다 22,,23. Microglia 유래 EV는 또한 큰 두뇌 지구24,,25에서사이토카인 중재한 선동반응을 전파할 수 있었습니다. 중요한 것은, 통행료 유사 수용체 패밀리를 위한 다양한 리간드가 마이크로글리아26에서EV의 특정 생산을 활성화시킬 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 시험관 내 연구는 LPS 활성화 미세글리아 BV2 세포주가 프로-염증성 사이토카인27을포함하는 차동 EV 함량을 생성한다는 것을 보여준다. 따라서, CNS, 마이크로글리아 및 침투 BMDM에서 면역 세포 하위 집단의 기능적 다양성은 수신자 세포에 대한 EV 영향 및 EV 내용물의 식별을 포함하여 자신의 EV 집단을 통해 평가될 수 있다.
우리는 이전에 그들의 격리16,,19후에 microglia-및 BMDM 유래 전기 의 기능적 특성을 평가하는 방법을 기술했습니다. 본 보고서에서, 우리는 신경구 의 자생에 마이크로 글리아 유래 전기 의 효과, 그리고 신경교종 세포 응집체의 제어에 대식세포 파생 전기 의 효과 독립적으로 평가하는 것이 제안한다. 이 연구는 또한 EV 격리 절차를 검증하고 생물학적 활성 단백질 시그니처를 식별하기 위해 EV 분획의 광범위한 단백질 분석을 제안합니다. 유익한 효과 와 EV 내용물의 분자 해독 그들의 가능한 조작 하 고 뇌 질환에 치료 에이전트로 사용 하는 데 도움이 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중추 신경계 (CNS)는 세포 간 통신이 항상성에 필요한 정상적인 신경 기능을 조절하는 복잡한 조직입니다30. 전기자동차는 현재 세포간 통신을 위한 중요한 분자화물(31)으로널리 연구되고 기술되고 있다. 그(것)들은 특히 건강하고 병리학적인 조건에 있는 그들의 기능에 영향을 미치는 수신자 세포에 중재자의 칵테일을 전달합니다32. 최근 연구…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
제시된 작품은 미니스테르 드 L’Education Nationale, 드 L’Enseignement 수페리어 에 드 라 레체르슈와 INSERM에 의해 지원되었다. 우리는 악기및 기술 자문에 대한 액세스 BICeL- 캠퍼스 과학 도시 시설을 감사하게 인정합니다. 장 파스칼 지메노, 소울라이마네 아불루아르, 이자벨 푸르니에가 질량분광에 도움을 주신 것을 진심으로 감사드립니다. 타니나 아랍, 크리스텔 반 캠프, 프랑수아 르 마레크-크로크, 야코포 비지올리, 피에르 에릭 소티에르가 과학 기술 발전에 크게 기여한 것을 감사드립니다.
Materials
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
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