Denna rapport belyser kronologiska krav för extracellulära vesikel (EV) isolering från mikroglia eller blod makrofager. Microglia-härledda EVs utvärderades som regulatorer av neurite utväxt medan blod makrofag-härledda EVs studerades i kontrollen av C6 gliom cell invasion i in vitro-analyser. Målet är att bättre förstå dessa EV-funktioner som immunmedlare i specifika mikromiljöer.
Neuroinflammatoriska tillståndet i centrala nervsystemet (CNS) spelar en nyckelroll i fysiologiska och patologiska tillstånd. Microglia, de bosatta immuncellerna i hjärnan, och ibland infiltrera benmärg-härledda makrofager (BMDMs), reglera den inflammatoriska profilen för deras mikromiljö i CNS. Det är nu accepterat att de extracellulära vesikel (EV) populationerna från immunceller fungerar som immunmedlare. Således är deras insamling och isolering viktiga för att identifiera deras innehåll men också utvärdera deras biologiska effekter på mottagarceller. De nuvarande data belysa kronologiska krav för EV isolering från mikroglia celler eller makrofager blod inklusive ultracentrifugering och storlek-exkludering kromatografi (SEC) steg. En icke-riktad proteomisk analys tillät validering av proteinsignaturer som EV-markörer och karakteriserade det biologiskt aktiva EV-innehållet. Microglia-härledda EVs användes också funktionellt på primär kultur av nervceller för att bedöma deras betydelse som immun medlare i neurite utväxt. Resultaten visade att microglia-härledda EVs bidrar till att underlätta neurite utväxt in vitro. Parallellt, blod makrofag-härledda EVs användes funktionellt som immun medlare i sfäroidkulturer av C6 gliom celler, resultaten visar att dessa EVs kontrollera glioma cell invasion in vitro. Denna rapport belyser möjligheten att utvärdera EV-medierad immuncell funktioner men också förstå de molekylära grunderna för en sådan kommunikation. Denna dechiffrera kan främja användningen av naturliga blåsor och/eller in vitro-beredning av terapeutiska blåsor för att efterlikna immunegenskaper i mikromiljön av CNS-patologier.
Många neuropatologier är relaterade till det neuroinflammatoriska tillståndet som är en komplex mekanism som alltmer övervägs, men fortfarande dåligt förstådda eftersom immunprocesserna är olika och är beroende av cellmiljön. Faktum är att CNS-störningarna inte systematiskt involverar samma aktiveringssignaler och immuncellpopulationer och därför är de pro- eller antiinflammatoriska reaktionerna svåra att utvärdera som orsaker eller konsekvenser av patologier. Hjärnan bosatt makrofager kallas “microglia” verkar vara på gränssnittet mellan nervsystemet och immunsystemet1. Microglia har ett myeloiskt ursprung och kommer från gulesäcken under primitiva hematopoiesis att kolonisera hjärnan, medan perifera makrofager härrör från fostrets lever under definitiva hematopoiesis att bli perifera makrofager2. Mikrogliacellerna kommunicerar med nervceller och neuron-härledda gliaceller såsom astrocyter och oligodendrocyter3. Flera nyligen genomförda studier har visat att mikroglia är involverade i neuronal plasticitet under CNS utveckling och vuxen vävnad homeostas, och även i det inflammatoriska tillstånd som är associerad med neurodegenerativa sjukdomar4,5. Annars kan blod- hjärnbarriärens integritet äventyras i andra CNS-patologier. Immunsvaren, särskilt i glioblastoma multiforme cancer, stöds inte bara av mikroglia celler som blod-hjärnbarriären omorganiseras genom angiogeniska processer och förekomsten av lymfkärl6,7. Därför förekommer en stor benmärgs-härledda makrofager (BMDMs) infiltration i hjärntumören i hela tumör-beroende angiogenes mekanismer8. Cancercellerna utövar ett betydande inflytande på infiltrerade BMDMs leder till immunsuppressiva egenskaper och tumörtillväxt9. Således är kommunikationen mellan immuncellerna och deras hjärnmikromiljö svår att förstå eftersom cellens ursprung och aktiveringssignaler är olika10,11. Det är därför intressant att gripa funktionerna hos immuncellsassocierade molekylära signaturer under fysiologiska tillstånd. I detta avseende kan cellcellskommunikationen mellan immunceller och cellmikromiljön studeras genom frisättning av extracellulära blåsor (EVs).
Elbilarna studeras mer och mer i regleringen av immunfunktioner i friska såväl som patologiska tillstånd12,13. Två populationer, exosomer och mikrovesmier, kan beaktas. De presenterar olika biogenes och storleksintervall. Exosomer är blåsor av ~30–150 nm diameter och genereras från det endosamala systemet och utsöndras under fusion av multiveskulära kroppar (MVBs) med plasmamembranet. Mikrovesiklarna är ca 100–1 000 nm i diameter och genereras av en utåtgående spirande från cellplasmamembranet14. Eftersom exosom kontra mikrovesicle diskriminering är fortfarande svårt att inse beroende på storlek och molekylära mönster, kommer vi bara använda termen EL I denna rapport. Ev-associerade kommunikation i CNS utgör en uråldriga mekanism eftersom studier visade att de var inblandade i ryggradslösa arter inklusive nematoder, insekter eller annelider15,16. Dessutom visar resultaten att elbilar kan kommunicera med celler från olika arter att denna mekanism är ett nyckellåssystem, som först bygger på ytmolekylerkännande mellan vesicles och mottagarceller och sedan möjliggör upptag av medlare16,17. EVs innehåller många molekyler som proteiner (t.ex. enzymer, signaltransduktion, biogenesfaktor), lipider (t.ex. ceramid, kolesterol) eller nukleinsyror (t.ex. DNA, mRNA eller miRNAs) som fungerar som direkta eller indirekta regulatorer av mottagarcellverksamheten14. Det är därför metodologiska studier utfördes också på immunceller för att isolera EL-apparater och helt karakterisera deras protein signaturer18,19.
De tidigaste studierna visade att exosomer frisläpps från primärkolsten råttmikroglia som en inducible mekanism efter en Wnt3a- eller serotonin-beroendeaktivering 20,21. Funktionellt i CNS, microglia-härledda EVs reglera synaptiska blåsor release av presynaptiska terminaler i nervceller som bidrar till kontroll av neuronal retbarhet22,23. Microglia-härledda EVs kan också propagera cytokiner-medierad inflammatorisk reaktion i stora hjärnregioner24,25. Viktigt, de olika ligands för avgiftsbelagda receptor familj kan aktivera specifika produktioner av elbilar i microglia26. Till exempel, in vitro-studier visar att LPS-aktiverade microglia BV2 cellinjer producerar differentiell EV innehåll inklusive proinflammatoriska cytokiner27. Därför kan den funktionella mångfalden av immuncellsubpopulationer i CNS, mikroglia och infiltrera BMDMs utvärderas genom sina egna EV-populationer, inklusive EV-påverkan på mottagarceller och identifiering av EV-innehåll.
Vi har tidigare beskrivit metoder för att utvärdera de funktionella egenskaperna hos microglia- och BMDM-härledda EVs efter deras isolering16,19. I denna rapport föreslår vi att självständigt utvärdera effekten av microglia-härledda EVs på neurite utväxt, och effekten av makrofag-härledda EVs på kontroll av glioma cell aggregat. Denna studie föreslår också en bred proteomisk analys av EV fraktioner för att validera EV isolering förfarande samt identifiera biologiskt aktiva protein signaturer. De positiva effekterna och den molekylära dechiffrera av EV innehåll kan hjälpa deras eventuella manipulation och användning som terapeutiska medel i hjärnsjukdomar.
Det centrala nervsystemet (CNS) är en komplex vävnad där cell-till-cell kommunikation reglerar normala neuronala funktioner som krävs för homeostas30. Elfordon studeras nu i stor utsträckning och beskrivs som viktiga molekylära laster för cell-till-cell-kommunikation31. De levererar specifikt en cocktail av medlare till mottagarceller och påverkar därmed deras funktioner under friska och patologiska tillstånd32. Nyligen genomförda studier…
The authors have nothing to disclose.
Det presenterade arbetet stöddes av Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche och INSERM. Vi bekräftar tacksamt BICeL- Campus Scientific City Facility för tillgång till instrument och teknisk rådgivning. Vi erkänner tacksamt Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard och Isabelle Fournier för masspektrometri hjälp. Vi erkänner tacksamt Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli och Pierre-Eric Sautière för deras starka bidrag till den vetenskapliga och tekniska utvecklingen.
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
FlexAnalysis | Brucker | ||
Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
Laminin | Corning | 354232 | |
MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
MiliQ water | Merck Millipore | ||
Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
PureCol | Cell Systems | 5005 | |
Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Slide | Dustsher | 100204 | |
Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris | Interchim | UP031657 | |
Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |