3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований
Summary
Целью этого протокола является создание 3D-модели in vitro для изучения дифференциации связанных с раком фибробластов (CAFs) в опухолевой оптоподобной среде, которая может быть решена в различных системах анализа, таких как иммунофлюоресценция, транскрипция анализ и визуализация клеток жизни.
Abstract
Определение идеальной модели для исследования in vitro имеет важное значение, главным образом при изучении физиологических процессов, таких как дифференциация клеток. В опухолевой стромы фибробласты-хозяина стимулируются раковыми клетками, чтобы дифференцироваться. Таким образом, они приобретают фенотип, который способствует микросреде опухоли и поддерживает прогрессирование опухоли. Используя сфероидную модель, мы создали такую 3D-модель in vitro, в которой мы проанализировали роль ламинина-332 и его рецептора и его рецептора в этом процессе дифференциации. Эта система сфероидной модели не только воспроизводит условия микроокружения опухоли более точным способом, но также является очень универсальной моделью, так как она позволяет различные исследования вниз по течению, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание как внутри-, так и внеклеточного маркеры, а также отложенные внеклеточные матричные белки. Кроме того, с помощью этой модели можно изучить транскрипционный анализ qPCR, цитометрию потока и клеточного вторжения. Здесь мы описываем протокол сфероидной модели для оценки роли интегрина ЦАФов No3 З1 и его эктопически отложенного лиганда, ламинина-332, в дифференциации и в поддержке вторжения раковых клеток поджелудочной железы.
Introduction
Микросреда опухоли является очень сложной нишей и чрезвычайно важно для поддержания и прогрессирования опухолевых клеток1. Он образуется не только раковыми клетками, но и стромальными фибробластами. Опухолевые клетки окружены стромы, которая специфична и отличается от стромы нормальных тканей2. Laminin-332 является внеклеточным матричным белком эктопически выражается в строми различных опухолей, таких как аденокарцинома поджелудочной железы3. Кроме того, биохимический состав ECM, а также его биофизические свойства, такиекак жесткость и напряжение, изменения в опухоли объем4 . Эта опухоль строма, или “реактивная строма”, вызвана адаптацией фибробластов к соседним раковым клеткам и набором других очень важных игроков, которые разрабатывают благоприятную и благоприятную среду для прогрессирования опухоли. Дифференциация стромальных фибробластов приводит к раку связанных фибробластов (CAF). Эти клетки могут быть идентифицированы с помощью различных маркеров, таких как плавный мышечный актин (ЗСМА)5 или нервный/глиальный антиген 2 (NG2)6.
Наиболее подходящая модель in vitro для повторения микроокружения опухоли (TME) с помощью CAFs трудно выбрать. Для такой модельной системы необходимо рассмотреть метод имитации физиологических параметров ТМЭ экономически эффективным и воспроизводимым способом. В рамках ТМЭ происходят различные процессы, такие как распространение, дифференциация, миграция и вторжение различных типов клеток. Эти клеточные процессы могут выполняться индивидуально с различными методами. Тем не менее, экспериментальные условия должны учитывать клеточные взаимодействия с опухолевой стромы ECM, так как жесткость субстрата влияет на процесс дифференциации CAF. Р.Г. Уэллс прокомментировал влияние матричной жесткости на поведение клеток и подчеркнул, что цитоскелетная организация и дифференциация статуса, наблюдаемые в клетках in vitro, могут быть артемовстовыми7. Различные стимулы, кажется, участвуют в дифференциации CAF, в том числе механическое напряжение5,7. Чтобы избежать этого, 2D мягкие субстраты могут быть возможными подходами для дифференциации исследований, так как они обходят проблему жесткой культуры блюдо пластика. Мягкая 2D поверхность, на которой фибробласты могут быть выращены, может быть коллагена-I покрытием полякриламид гели, в котором гель жесткость может манипулировать концентрацией полиакриламид и гель поперечный-ссылки. Стегея и образование богатых SMA стрессовых волокон усиливаются в фибробластах вместе с гель жесткость8. Эти результаты подчеркивают важность мягких подсашных лесов субстрата для более физиологических моделей дифференциации in vitro. Тем не менее, в наших руках экспериментальной воспроизводимости и визуализации этих гелей были сложными. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы изменили 2D мягкую систему субстрата для 3D сфероидной модели для дифференциации и исследований вторжения. Эта модель является более клинически актуальной и, подобно органоиду in vitro, резюмирует взаимодействия в виво-клеточных клетках, производство и осаждение ECM, а также поведение клеток9.
Сфероиды образуются, когда клетки не хватает субстрата придерживаться. Когда клетки остаются без клейкой поверхности, они объединяются, образуя более или менее сферическую структуру. Если сфероиды состоят из одного типа клеток, они называются гомосфероидами; если состоит из двух или более различных типов клеток они образуют гетеросфероиды.
Среди различных методов подготовки сфероидов, мы выполняем протокол с использованием неадекнтных круглых нижних 96-колодцев. Он очень эффективен в отношении затрат. Здесь мы производим как гомосфероиды фибробластов, CAF или CAFs не хватает integrin No3 подразделение для изучения процесса дифференциации и гетеросфероидов CAFs или integrin No 3 KO CAFs и поджелудочной железы клетки карциномы (AsPC-I и PANC-I) для изучения вторжения в окружающую матрицу.
Целью этих исследований было использование первичных ЦАФов, изолированных от биопсии карциномы поджелудочной железы человека. Тем не менее, биопсии для получения клеток являются скудными, и по этой причине, CAFs, используемых в этих исследованиях были увековечены с использованием лентивирус, содержащий HTERT. Они называются iCAFs, и их нормальные аналоги, первичные человеческие фибробласты поджелудочной железы, называются iNFs. Фибробласты поджелудочной железы человека и клетки карциномы поджелудочной железы, AsPC-I и PANC-I, являются коммерчески доступными.
Этот протокол был использован для изучения влияния взаимодействия ламинина-332-итегрина в процессе дифференциации CAF. Чтобы доказать специфику этого взаимодействия и его функции, ингибиторные соединения были использованы: BM2, моноклональное антитело, которое блокирует место связывания интегрина ламинин-332 No3 цепи10, или lebein 1, змея яд производные соединения, которое блокирует ламинин-связывающие атегрины No3 Х1, No6 и 7 -111,12.
Для анализа вторжения, клетки были трансуминированы с лентивирусом, содержащим cDNA кодирования либо mCherry (iCAFs и integrin No 3 KO iCAFs) или GFP (AsPC-I и PANC-I), чтобы различать различные типы клеток в гетеросфероидах. Трансдукция клеток, чтобы увековечить их и / или пометить их флуоресцентным протением (mCherry и GFP) выражение описано в предыдущем исследовании13, которые следует проконсультироваться для получения дополнительной информации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработка соответствующей модели in vitro для изучения дифференциации CAF является сложной задачей. После использования различных подходов, мы пришли к выводу, что 3D сфероидная модель является более практичной, физиологической и клинически актуальной моделью, в которой взаимодействие ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем помощь Барбары Шеддинг в подготовке BM2 и lebein-1. Мы признательны Огнес Ноэль за то, что она поделилась своим опытом в сфероидных анализах. Мы благодарим Соню Шелхаас и Михаэля Шефера за помощь в обработке трансфекции лентивирвейра в условиях S2. Мы признаем помощь Сабины фон Рорден в подготовке ЦАФов из ткани рака поджелудочной железы.
Исследования, приведившие к этим результатам, получили финансирование от Программы «Люди» (Marie Curie Actions) Седьмой рамочной программы Европейского союза FP7/2017-2013/ в соответствии с соглашением о предоставлении грантов REA (316610) J.A.E. Кроме того, J.A.E. и A.C.M.C. оказывали финансовую поддержку Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках кластера передового опыта «Клетки в движении» (EXC 1003-CiM). Этот проект также был поддержан Вильгельмом Сандером Стифтунгом (грант: 2016.113.1 до J.A.E.).
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?. Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco, ., C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -. C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
