Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro
Summary
L’objectif de ce protocole est d’établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d’analyse, tels que l’immunofluorescence, la transcription l’analyse et l’imagerie des cellules de vie.
Abstract
Définir le modèle idéal pour une étude in vitro est essentiel, principalement si l’étude des processus physiologiques tels que la différenciation des cellules. Dans le stroma tumoral, les fibroblastes hôtes sont stimulés par les cellules cancéreuses pour se différencier. Ainsi, ils acquièrent un phénotype qui contribue au microenvironnement tumoral et soutient la progression tumorale. En utilisant le modèle sphéroïde, nous avons mis en place un tel système de modèle in vitro 3D, dans lequel nous avons analysé le rôle de la laminin-332 et son récepteur integrin 3-1 dans ce processus de différenciation. Ce système de modèle sphéroïde reproduit non seulement les conditions de microenvironnement de tumeur d’une manière plus précise, mais est également un modèle très polyvalent puisqu’il permet différentes études en aval, telles que la coloration immunofluorescente de l’intra- et de l’extracellulaire marqueurs, ainsi que les protéines de matrice extracellulaire déposées. En outre, les analyses transcriptionnelles par qPCR, la cytométrie de flux et l’invasion cellulaire peuvent être étudiées avec ce modèle. Ici, nous décrivons un protocole d’un modèle sphéroïde pour évaluer le rôle de l’integrin de CAFs ‘3’1 et son ligand ectopique déposé, laminin-332, dans la différenciation et en soutenant l’invasion des cellules cancéreuses pancréatiques.
Introduction
Le microenvironnement tumoral est une niche très complexe et extrêmement importante pour le maintien et la progression des cellules tumorales1. Il est formé non seulement par les cellules cancéreuses, mais aussi par les fibroblastes stromaux. Les cellules tumorales sont entourées d’un stroma qui est spécifique et différent du stroma des tissus normaux2. Lalaminin-332 est une protéine de matrice extracellulaire ectopiquement exprimée dans le stroma de différentes tumeurs, telles que de l’adénocarcinome pancréatique3. En outre, la composition biochimique de l’ECM et aussi ses propriétés biophysiques, telles que la rigidité et la tension, changent dans le volume de tumeur4. Ce stroma tumoral, ou « stroma réactif », est causé par une adaptation des fibroblastes aux cellules cancéreuses voisines et par le recrutement d’autres acteurs très importants qui développent un environnement favorable et favorable à la progression tumorale. La différenciation des fibroblastes stromaux entraîne des fibroblastes associés au cancer (CAF). Ces cellules peuvent être identifiées à l’aide de différents marqueurs tels que l’actine musculaire lisse (SMA)5 ou l’antigène neural/glial 2 (NG2)6.
Le modèle in vitro le plus approprié pour récapituler le microenvironnement tumoral (TME) avec les CAT est difficile à sélectionner. La méthode pour imiter les paramètres physiologiques du TME d’une manière rentable et reproductible doit être considérée pour un tel système modèle. Dans le TME, différents processus, tels que la prolifération, la différenciation, la migration et l’invasion des différents types de cellules se produisent. Ces processus cellulaires peuvent être effectués individuellement avec différentes méthodes. Cependant, les conditions expérimentales doivent considérer les interactions cellulaires avec l’ECM de stroma de tumeur, puisque la rigidité du substrat influence le processus de différenciation de CAF. R.G. Wells a commenté sur l’impact de la rigidité de matrice sur le comportement cellulaire et a souligné que l’organisation cytosquelettique et le statut de différenciation observés dans les cellules cultivées in vitro pourraient être artéfactuels7. Différents stimuli semblent être impliqués dans la différenciation des FAC, y compris la tension mécanique5,7. Pour éviter cela, les substrats mous 2D pourraient être des approches possibles pour les études de différenciation, car ils contournent le problème du plastique plat de culture rigide. Une surface 2D douce, sur laquelle les fibroblastes peuvent être cultivés, peut être des gels polyacrylamide enduits de collagène-I, par lesquels la rigidité du gel peut être manipulée par la concentration de polyacrylamide et le gel cross-linker. L’adhérence et la formation de fibres de stress riches en SMA sont renforcées dans les fibroblastes avec la rigidité du gel8. Ces résultats soulignent l’importance des échafaudages de substrat souple pour des modèles de différenciation in vitro plus physiologiques. Cependant, dans nos mains la reproductibilité expérimentale et l’imagerie de ces gels étaient provocants. Pour surmonter ces lacunes, nous avons changé le système de substrat souple 2D pour un modèle sphéroïde 3D pour des études de différenciation et d’invasion. Ce modèle est plus pertinent sur le plan clinique et, à l’instar d’un organoïde in vitro, récapitule les interactions cellules-cellules in vivo, la production et le dépôt d’ECM, ainsi que le comportement cellulaire9.
Les sphéroïdes se forment lorsque les cellules n’ont pas de substrat auquel adhérer. Lorsque les cellules sont laissées sans surface adhésive, elles s’agrégent pour former une structure plus ou moins sphérique. Si les sphéroïdes sont composés d’un type de cellule, ils sont appelés homosphéyoïdes; s’ils sont composés de deux ou plusieurs types de cellules différents, ils forment des hétérorosphétoïdes.
Parmi les différentes méthodes de préparation sphéroïde, nous effectuons le protocole en utilisant des plaques rondes non adhérentes en bas de 96 puits. Il est très efficace en ce qui concerne les coûts. Ici, nous produisons à la fois des homosphéroïdes de fibroblastes, caf ou CAFs dépourvus de l’integrin 3 sous-unité pour examiner le processus de différenciation et les hétérorosphénoïdes des CAF ou intégrine 3 CAF ko et cellules de carcinome des canaux pancréatiques (AsPC-I et PANC-I) pour étudier l’invasion dans la matrice environnante.
L’objectif de ces études était d’utiliser des CAF primaires isolés des biopsies du carcinome pancréatique humain. Cependant, les biopsies pour obtenir les cellules sont rares et pour cette raison, les CAF utilisés dans ces études ont été immortalisés à l’aide de lentivirus contenant HTERT. Ils sont appelés iCAFs, et leurs homologues normaux, fibroblastes pancréatiques humains primaires, sont appelés iNFs. Les fibroblastes pancréatiques humains et les cellules du carcinome des canaux pancréatiques, AsPC-I et PANC-I, sont disponibles dans le commerce.
Ce protocole a été employé pour étudier l’effet de l’interaction laminin-332-integrin dans le processus de différenciation de CAF. Pour prouver la spécificité de cette interaction et de sa fonction, des composés inhibiteurs ont été utilisés : BM2, un anticorps monoclonal qui bloque le site de liaison intégrine de la chaîne laminin-332 310, ou lebein 1, un composé dérivé du venin de serpent qui bloque le integrins laminin-contraignants 3,1, 6 et 11,12.
Pour l’analyse d’invasion, les cellules avaient été transduisées avec le lentivirus contenant l’encodage de cDNA codant soit mCherry (iCAFs et integrin s’il n’y a pas 3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I et PANC-I) pour distinguer les différents types de cellules dans les hétérorosphénoïdes. La transduction des cellules pour les immortaliser et/ou pour les étiqueter avec l’expression de protéine fluorescente (mCherry et GFP) est décrite dans une étude précédente13,qui devrait être consultée pour plus d’informations.
Protocol
Representative Results
Discussion
Développer un modèle in vitro approprié pour étudier la différenciation des FAC est une tâche difficile. Après avoir utilisé différentes approches, nous avons conclu qu’un modèle sphéroïde 3D est le modèle le plus pratique, physiologique et cliniquement pertinent, dans lequel l’interaction entre les cellules du carcinome pancréatique avec des CAF immortalisés peut être étudiée. Ce modèle a empêché la différenciation spontanée des fibroblastes, due aux facteurs de stress artéfactuels tels que la ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l’aide de Barbara Schedding dans la préparation du BM2 et du lebein-1. Nous remercions Àgnes Noel d’avoir partagé son expertise dans les essais sphéroïdes. Nous remercions Sonja Schelhaas et Michael Schàfers pour leur aide dans la gestion de la transfection lentivirale dans des conditions S2. Nous reconnaissons l’insistance de Sabine von Ràden dans la préparation des CAF à partir de tissus cancéreux pancréatiques.
La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Programme des personnes (Actions Marie Curie) du septième programme-cadre de l’Union européenne, le 7e PC/2007-2013/ dans le cadre de l’accord de subvention REA (316610) à J.A.E. De plus, J.A.E. et A.C.M.C. ont reçu le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au sein du Cluster d’excellence Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Ce projet a également été soutenu par Wilhelm Sander Stiftung (subvention: 2016.113.1 à J.A.E.).
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
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