Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.
Het definiëren van het ideale model voor een in vitro studie is essentieel, vooral als het bestuderen van fysiologische processen zoals differentiatie van cellen. In de tumor stroma, gastheer fibroblasten worden gestimuleerd door kankercellen te differentiëren. Dus, ze verwerven een fenotype dat bijdraagt aan de tumor micro omgeving en ondersteunt de progressie van de tumor. Door gebruik te maken van het spheroid-model hebben we zo’n 3D in vitro modelsysteem opgezet, waarin we de rol van laminin-332 en de receptor integrine α3β1 in dit differentiatieproces analyseerden. Dit spheroid-modelsysteem reproduceert niet alleen de omstandigheden van de tumor microomgeving op een nauwkeurigere manier, maar is ook een zeer veelzijdig model, omdat het verschillende downstreamonderzoeken mogelijk maakt, zoals immunofluorescentie kleuring van zowel intra-als extracellulaire markers, evenals gedeponeerde extracellulaire matrix eiwitten. Bovendien kunnen transcriptionele analyses van qPCR, flow cytometrie en cellulaire invasie met dit model worden bestudeerd. Hier beschrijven we een protocol van een spheroid-model om de rol van CAFs ‘ integrine α3β1 te beoordelen en zijn ectopisch gestorte ligand, laminin-332, in differentiatie en ter ondersteuning van de invasie van pancreaskanker cellen.
De tumor micro Environment is een zeer complexe niche en uiterst belangrijk voor het onderhoud en de progressie van de tumorcellen1. Het wordt niet alleen gevormd door de kankercellen, maar ook door stromale fibroblasten. De tumorcellen zijn omgeven door een stroma die specifiek is en verschillend van de stroma van normale weefsels2. Laminine-332 is een extracellulair matrix eiwit ectopisch uitgedrukt in de stroma van verschillende tumoren, zoals pancreas adenocarcinoom3. Bovendien, de biochemische samenstelling van de ECM en ook haar biofysische eigenschappen, zoals stijfheid en spanning, verandering binnen de tumor bulk4. Deze tumor stroma, of “reactieve stroma”, wordt veroorzaakt door een aanpassing van fibroblasten aan de naburige kankercellen en door de werving van andere zeer belangrijke spelers die een gunstige en ondersteunende omgeving voor tumorprogressie ontwikkelen. De differentiatie van stromale fibroblasten resulteert in kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF). Deze cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van verschillende markers zoals α-gladde spier actine (αsma)5 of neurale/glial antigeen 2 (ng2)6.
Het meest geschikte in vitro model om de tumor micro Environment (TME) met CAFS te recapituleren is moeilijk te selecteren. De methode voor het nabootsen van fysiologische parameters van de TME op een kostenefficiënte en reproduceerbare manier moet worden overwogen voor een dergelijk modelsysteem. Binnen de TME, verschillende processen, zoals proliferatie, differentiatie, migratie en invasie van de verschillende celtypen optreden. Deze cellulaire processen kunnen individueel worden uitgevoerd met verschillende methoden. Echter, de experimentele omstandigheden moeten rekening houden met de cellulaire interacties met de tumor stroma ECM, aangezien de stijfheid van de substratum invloed op de CAF differentiatieproces. R.G. Wells becommentarieerde de impact van matrix stijfheid op Celgedrag en benadrukte dat cytoskelet organisatie en differentiatie status waargenomen in in vitro gekweekte cellen mogelijk artefeitelijk7. Verschillende stimuli lijken te worden betrokken bij CAF differentiatie, met inbegrip van mechanische spanning5,7. Om dit te voorkomen, kunnen 2D zachte substraten mogelijk benaderingen voor differentiatie studies, als ze het probleem van de stijve cultuur schotel plastic omzeilen. Een zacht 2D-oppervlak, waarop fibroblasten kunnen worden geteeld, kan collageen-I gecoate polyacrylamidegels zijn, waarbij de gelstijfheid kan worden gemanipuleerd door de concentratie van polyacrylamide en de gel cross-linker. De hechting en vorming van αSMA-rijke stress vezels worden versterkt in fibroblasten samen met de gel stijfheid8. Deze resultaten benadrukken het belang van zachte substraat steigers voor meer fysiologische in vitro differentiatie modellen. Echter, in onze handen waren de experimentele reproduceerbaarheid en beeldvorming van deze gels uitdagend. Om deze tekortkomingen te overwinnen, veranderden we het 2D zachte substraat systeem voor een 3D-spheroid-model voor differentiatie en invasie studies. Dit model is meer klinisch relevant en, vergelijkbaar met een in vitro organoïde, aan in vivo celcelinteracties, ECM productie en depositie, evenals Celgedrag9.
Spheroids worden gevormd wanneer cellen een substraat missen om zich aan te houden. Wanneer de cellen worden gelaten zonder een lijm oppervlak, ze aggregeren om een meer of minder sferische structuur te vormen. Als de sferoïden zijn samengesteld uit één type cel, worden ze homo-spheroïden genoemd; Als het bestaat uit twee of meer verschillende celtypen, vormen ze heterospheroids.
Onder de verschillende methoden voor het bereiden van spheroid voeren we het protocol uit met niet-aanhandige ronde bodem 96-well Plates. Het is zeer effectief met betrekking tot de kosten. Hier produceren we zowel homospheroïden van fibroblasten, CAF of CAFs zonder de integrine α3-subeenheid om het differentiatieproces te onderzoeken en heterospheroïden van CAFs of integrine α3 KO CAFs en pancreas cellen van de alvleesklier (AsPC-I en PANC-I) om de invasie te bestuderen in de omringende matrix.
Het doel voor deze studies was het gebruik van primaire CAFs geïsoleerd van menselijke alvleesklier carcinoom biopsies. Echter, de biopsieën om de cellen te verkrijgen zijn schaars en om deze reden, de CAFs gebruikt in deze studies zijn vereeuwigd met behulp van lentivirus met HTERT. Ze heten icafs, en hun normale tegenhangers, primaire menselijke alvleesklier fibroblasten, worden genoemd INFS. De humane alvleesklier fibroblasten en de tumorcellen van de alvleesklier, AsPC-I en PANC-I, zijn in de handel verkrijgbaar.
Dit protocol werd gebruikt om het effect van de interactie laminin-332-integrin in het CAF-differentiatieproces te bestuderen. Om de specificiteit van deze interactie en zijn functie te bewijzen, werden remmer-verbindingen gebruikt: BM2, een monoklonaal antilichaam dat de integrine bindingsplaats de laminin-332 α3 keten10, of lebein 1, een slang Venom afgeleide stof blokkeert die de laminine binding Integrins α3β1, α6β1 en α7β111,12.
Voor de invasie test waren cellen met lentivirus, die cDNA-codering bevatten, ofwel mCherry (iCAFs en integrine α3 KO iCAFs) of GFP (AsPC-I en PANC-I) om de verschillende celtypen in de heterospheroïden te onderscheiden. De transductie van de cellen om ze te vereeuwigen en/of om ze te labelen met een fluorescerende proteïne (mCherry en GFP) expressie wordt beschreven in een eerdere studie13, die moet worden geraadpleegd voor meer informatie.
Het ontwikkelen van een geschikt in vitro model om CAF-differentiatie te bestuderen is een uitdagende taak. Na het gebruik van verschillende benaderingen concludeerden we dat een 3D-spheroid-model het praktischer, fysiologisch en klinisch relevant model is, waarin het samenspel tussen pancreas carcinoom cellen met vereeuwigd CAFs kan worden bestudeerd. Dit model voorkwam spontane differentiatie van fibroblasten, als gevolg van artefeitelijke stressoren zoals de stijfheid van de celcultuur kunststof, althans in korte-term…
The authors have nothing to disclose.
We erkennen de hulp van Barbara Schedding bij het voorbereiden van de BM2 en lebein-1. We erkennen Àgnes Noel voor het delen van haar expertise in spheroid-assays. We danken Sonja Schelhaas en Michael Schäfers voor hun hulp bij het hanteren van linvirale transfectie onder S2-condities. We erkennen Sabine von Rüden’s assistentie in het bereiden van CAFs van pancreaskanker weefsel.
Het onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van het people-programma (Marie Curie-acties) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie KP7/2007-2013/onder de REA subsidieovereenkomst n ◦ (316610) tot en met J.A.E. Bovendien werd J.A.E. en A.C.M.C. financieel gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de cellen-in-Motion cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Dit project werd ook gesteund door Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
Albumin Fraction V – BSA | AppliChem | A1391 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
Dnase I | Roche | 10104159001 | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
Incubator | Heraeus | B6060 | |
Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |