Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias
Summary
Este estudio describe un método para aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factores estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos inmunoestimulantes a partir de células madre embrionarias.
Abstract
Las células madre embrionarias (CES) son células madre pluripotentes capaces de autorrenovarse y diferenciarse en todo tipo de células embrionarias. Al igual que muchos otros tipos de células, las CES liberan pequeñas vesículas de membrana, como los exosomas, al entorno extracelular. Los exosomas sirven como mediadores esenciales de la comunicación intercelular y desempeñan un papel básico en muchos procesos (pato)fisiológicos. El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) funciona como una citoquina para modular la respuesta inmune. La presencia de GM-CSF en exosomas tiene el potencial de aumentar su función inmuno-reguladora. Aquí, GM-CSF se sobreexpresó de manera estable en la línea celular ESC murina ES-D3. Se desarrolló un protocolo para aislar vesículas extracelulares (VE) enriquecidas con exosomas de alta calidad de células ES-D3 que sobreexpresan GM-CSF. Los vehículos eléctricos aislados enriquecidos con exosomas se caracterizaron por una variedad de enfoques experimentales. Es importante destacar que se encontró que cantidades significativas de GM-CSF estaban presentes en los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. En general, los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas que contienen GM-CSF de las CES podrían funcionar como vesículas libres de células para ejercer sus actividades inmunorreguladoras.
Introduction
Las CES se derivan de la etapa de blastocisto de un embrión preimplantacional1. Como células madre pluripotentes, las ESC tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en cualquier tipo de célula embrionaria. Debido a su notable potencial de desarrollo y capacidad proliferativa a largo plazo, los CES son extremadamente valiosos para la investigación biomédica1. Los esfuerzos de investigación actuales se han centrado en gran medida en el potencial terapéutico de las CES para una variedad de trastornos patológicos importantes, como la diabetes, las enfermedades cardíacas y las enfermedades neurodegenerativas2,3,4.
Se sabe que las células de mamíferos, incluidas las CES, liberan vesículas con tamaños variables al entorno extracelular, y estas EV poseen muchas funciones fisiológicas y patológicas debido a su papel en la comunicación intercelular5. Entre los diferentes subtipos de EVs, los exosomas son pequeñas vesículas de membrana liberadas desde varios tipos de células en el espacio extracelular tras la fusión de compartimentos endocíticos intermedios, cuerpos multivesiculares (MVB), con la membrana plasmática6. Se ha informado que los exosomas median la comunicación intercelular y están críticamente involucrados en muchos procesos (pato)fisiológicos7,8. Los exosomas heredan algunas funciones biológicas de sus propias células parentales, porque los exosomas contienen materiales biológicos adquiridos del citosol, incluidas proteínas y ácidos nucleicos. Así, los antígenos o factores asociados que estimulan la respuesta inmune específica para una enfermedad dada se encapsulan en los exosomas de tipos particulares de células9. Esto allanó el camino para los ensayos clínicos que exploran los exosomas derivados de tumores como una vacuna contra el cáncer10.
GM-CSF es una citocina secretada por diferentes tipos de células inmunes11. La evidencia emergente demuestra que el GM-CSF activa y regula el sistema inmunológico y desempeña un papel esencial en el proceso de presentación de antígenos12. Por ejemplo, un informe clínico sugiere que GM-CSF estimula la respuesta inmune a los tumores como adyuvante de la vacuna13. Varias estrategias de inmunoterapia contra el cáncer basadas en GM-CSF para explotar la potente actividad inmunoestimuladora de GM-CSF han sido investigadas en ensayos clínicos14. Entre estos, una vacuna contra el cáncer compuesta de células tumorales secretoras de GM-CSF irradiadas ha demostrado ser prometedora en pacientes con melanoma avanzado al inducir respuestas antitumorales celulares y humorales y la necrosis posterior en tumores metastásicos15.
Debido a que los exosomas derivados de las CES poseen actividades biológicas similares a las CES originales, tal vez los exosomas portadores de GM-CSF de las CSC podrían funcionar como vesículas libres de células para regular la respuesta inmune. En este artículo, se describe un método detallado para producir vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas de alta calidad a partir de CES que expresan GM-CSF. Estos vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas tienen el potencial de servir como vesículas inmunorreguladoras para modular la respuesta inmune.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio muestra un método altamente eficiente para producir vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas que transportan la proteína inmunoestimulante GM-CSF, que se puede emplear para estudiar los efectos inmunomoduladores de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. Varios estudios sugieren que los exosomas exhiben funciones inmunorreguladoras y antitumorales22. Por lo tanto, los exosomas de las CES que expresan GM-CSF también podrían poseer actividades biológicas que r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Sr. Arkadiusz Slusarczyk y a kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imágenes de microscopio electrónico de transmisión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 y CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) y Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
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