胚性幹細胞からの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離
1Department of Pharmacology and Toxicology,University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center,University of Louisville, 3Department of Medicine,University of Louisville, 4Department of Surgery,University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center,University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology,University of Louisville
Summary
この研究では、胚性幹細胞から免疫刺激性顆粒球マクロファージマクロファージを担う外生富化細胞外小胞を単離する方法について説明する。
Abstract
胚性幹細胞(ESC)は、自己再生および分化が可能な多能性幹細胞であり、すべてのタイプの胚細胞に分化することができる。他の多くの細胞タイプと同様に、ESCはエキソソームなどの小さな膜小胞を細胞外環境に放出する。エキソソームは細胞間コミュニケーションの不可欠なメディエーターとして機能し、多くの(パソ)生理学的プロセスにおいて基本的な役割を果たす。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、免疫応答を調節するサイトカインとして機能する。エキソソームにおけるGM-CSFの存在は、免疫調節機能を高める可能性を秘めています。ここで、GM-CSFは、マウスESC細胞株ES-D3において安定的に過剰発現していた。GM-CSFを過剰発現するES-D3細胞から高品質のエキソソームエンリッチ細胞小胞(EV)を分離するプロトコルが開発されました。分離エキソソームエンリッチEVは、様々な実験的アプローチによって特徴付けられていた。重要なことに、大量のGM-CSFがエキソソームエンリッチEVに存在することが判明した。全体として、ESCからのGM-CSFを持つエキソソームエンリッチEVは、免疫調節活動を行うために無細胞小胞として機能する可能性があります。
Introduction
ESCは、着床前胚1の胚盤胞期に由来する。多能性幹細胞として、ESCは自己更新し、あらゆるタイプの胚細胞に分化する能力を有する。その著しい発達力と長期的な増殖能力のために、ESCは生物医学研究のために非常に価値がある1.現在の研究努力は、糖尿病、心臓病、および神経変性疾患2、3、4を含む様々な主要な病的障害に対するESCの治療可能性に主に焦点を当てている。
ESCを含む哺乳類細胞は、細胞外環境に可変サイズの小胞を放出することが知られており、これらのEVは細胞間コミュニケーションにおけるそれらの役割のために多くの生理学的および病理学的機能を有する5。EVの異なるサブタイプの中で、エキソソームは、中間内視鏡コンパートメント、多胞体(MVB)の融合時に細胞外空間に様々な細胞タイプから放出される小さな膜小胞である、血漿膜6を有する。エキソソームは細胞間通信を媒介することが報告されており、多くの(パソ)生理学的プロセス7,8に批判的に関与している。エキソソームは、タンパク質や核酸を含むサイトゾルから得られた生物学的物質を含んでいるため、自分の親細胞からいくつかの生物学的機能を継承します。従って、特定の疾患に特異的な免疫応答を刺激する関連抗原または因子は、特定のタイプの細胞9からエキソソームに封入される。これは、抗癌ワクチン10として腫瘍由来エキソソームを探索する臨床試験への道を開いた。
GM-CSFは、異なるタイプの免疫細胞11によって分泌されるサイトカインである。新たな証拠は、GM-CSFが免疫系を活性化し、調節し、抗原提示プロセス12において不可欠な役割を果たしていることを示す。例えば、臨床報告は、GM-CSFがワクチンアジュバント13として腫瘍に対する免疫応答を刺激することを示唆している。GM-CSFの強力な免疫刺激活性を利用するいくつかのGM-CSFベースの癌免疫療法戦略は、臨床試験14で調査されている。これらの中で、照射されたGM-CSF分泌腫瘍細胞からなるがんワクチンは、転移性腫瘍15において細胞および体液性抗腫瘍応答とその後の壊死を誘導することによって進行した黒色腫患者に何らかの約束を示している。
ESCに由来するエキソソームは元のESCと同様の生物学的活性を有するため、ESCからのGM-CSFを運ぶエキソソームは、免疫応答を調節するための無細胞小胞として機能する可能性があります。本論文では、GM-CSFを発現するESCから高品質エキソソームエンリッチEVを製造する詳細な方法を説明する。これらのエキソソームエンリッチEVは、免疫応答を調節する免疫調節小胞として機能する可能性を秘めています。
Protocol
1. ES-D3細胞の培養 エキソソームフリーウシ血清(FBS)を生成するには、FBSを超遠心分離機に、遠心分離機を100,000 x g で4°Cで16時間ロードします。 遠心分離後、マウスESC細胞株ES-D3を培養し、エキソソームエンリッチEVを取得するためのエキソソームフリーFBSとして血清上清を収集します。 ES-D3細胞をめっきする前に、ゼラチン(0.1%)を室温で30分間使用して15cmの組織培養皿を?…
Representative Results
GM-CSFはマウスESCで過剰発現している。ES-D3細胞中でGM-CSFを安定的に過剰発現させるために、マウスGM-CSF cDNAをトランスフェクションベクターにクローニングし、発現ベクターpEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFPを生成した(図1A)。GM-CSFはトランスフェクションによりES-D3細胞で過剰発現し、一過性トランスフェクションES-D3細胞の約20%がG…
Discussion
本研究は、免疫刺激タンパク質GM-CSFを有するエキソソームエンリッチEVを産生する非常に効率的な方法を示し、エキソソームエンリッチEVの免疫調節効果を研究するために使用することができる。いくつかの研究は、エキソソームが免疫調節および抗腫瘍機能22を示すことを示唆している。したがって、GM-CSFを発現するESCのエキソソームは、免疫応答を調節する生物学的活性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
透過型電子顕微鏡画像を取得してくれたアルカディウシュ・スルサルチク氏とケンタッキー州生物医学研究基盤ネットワーク(KBRIN、P20GM103436)に感謝しています。この研究の一環として、NIH AA018016-01(J.W.E.)、ケンタッキー州連邦リサーチチャレンジトラストファンド(J.W.E.)、NIH CA106599、CA175003(C.L.)、NIH CA198249(K.Y.)、フリー・オブ・ブレス・リサーチ・グラント(K.Y.)からの助成金が支えられました。
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
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Cite This Article
Meng, S., Whitt, A. G., Tu, A., Eaton, J. W., Li, C., Yaddanapudi, K. Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (177), e60170, doi:10.3791/60170 (2021).