小鼠前列腺器官代表一个有前途的环境来评估调节分化的机制。本文介绍了一种建立前列腺有机体的改进方法,并介绍了(1)从有机体中收集蛋白质易脂物的方法,以及(2)全贴联显显微镜的修复和染色有机体。
前列腺上皮主要由基底细胞和发光细胞组成。体内系系追踪已用于定义小鼠前列腺基底和发光细胞在发育、组织再生和转化过程中的分化能力。然而,使用系界线追踪方法评估前列腺上皮分化能力的细胞内向和外在调节器通常需要广泛的育种,并且可能成本高昂。在前列腺器官测定中,基底细胞和发光细胞在活体前产生前列腺上皮。重要的是,初级上皮细胞可以从任何遗传背景的小鼠或经过任意数量的小分子治疗的小鼠中分离出来,在电镀到三维(3D)培养中。7-10 天后生成足够的材料用于评估分化能力。通过西印体对(1)蛋白质进行分析的基基衍生物和发光衍生有机物的收集,以及(2)通过全装共聚焦显微镜对完整有机体进行免疫组织化学分析,使研究人员能够评估体外分化前列腺上皮细胞的能力。当结合使用时,这两种方法提供有关前列腺基础细胞和发光细胞在基因或药理操作方面的分化能力的补充信息。
基础细胞和发光细胞构成前列腺上皮1的大部分。血统追踪研究表明,这些细胞类型主要是由成年小鼠2中不同的祖细胞自我维持;然而,在包括发育3、4、组织再生5、炎症6、7和前列腺癌起始2、8在内的几种情况下,观察到了与基基祖子的亮度分化。此外,新兴数据支持多能发光后代的存在以及发光承诺的祖子9。在转移性前列腺癌中,从AR依赖性发光系向具有基础和神经内分泌特征的AR-无差别系分化代表一种日益被重视的对雄激素通路抑制剂10、11、12的抗药性机制。因此,由于分化涉及正常生理学、癌症启动和治疗阻力,阐明前列腺上皮细胞分化的关键分子调节剂至关重要。
小鼠前列腺器官模型已成为研究前列腺上皮细胞分化的优雅前体环境9,13,14。在此测定中,单个上皮细胞被镀成3D矩阵,在1周内生成包含基底细胞和发光细胞的腺体结构。虽然现有的将细胞电镀成有机体培养的方法可以用来有效地生成有机体,但这些方法需要进一步优化14。与培养前列腺有机体相关的显著挑战包括:(1) 从分析中排除在 Matrigel(基质凝胶)下方形成的二维 (2D) 菌落,(2) 在介质变化期间保持基质凝胶的完整性,以及 (3) 准确计数有机体。本文概述了从从小鼠前列腺分离的上皮细胞生成器官的方法。所述方法要求涂覆含有聚物(2-羟基乙二醇甲酸酯)(Poly-HEMA),以防止2D菌落的发生。此外,细胞被镀成基质凝胶环,而不是基质凝胶盘,这使得改变介质和计数器官不那么具有挑战性。这些技术使研究人员能够更轻松地研究在器官形成之前或过程中引入的基因改变或小分子如何改变关键过程,如分化。
通过全座共聚焦显微镜采集用于西印或免疫组织化学分析的前列腺器官,可以为分化13提供有价值的力学见解,但缺乏为此类技术制备有机体的协议。本手稿描述了收集有机物的方法 (1) 收集蛋白质莱沙,或 (2) 固定和染色,用于共聚焦显微镜。重要的是,与现有方法相比,所述用于固定和染色前列腺器官的方法得到了很大的改进。虽然这些依赖于切片有机体15,本手稿中描述的方法使用完整的有机体,这有助于防止样品制备过程中的器官损伤。当结合使用时,西印体和共聚焦显微镜可以为对分化的分子调节器提供有价值的见解。或者,这些方法可用于建模其他过程,如开发和转换。
前列腺上皮细胞分化已牵连于正常前列腺生物学2,3,4,5,6,7和疾病生物学8,10,11,12;但是,此过程的主调节器仍未定义。识别前列腺上皮细胞分化的关键调节器非常困难,部分原因是缺乏完善的环境来建模它。虽然2D单层培养法可以用来模拟分化11,12,但这个背景无法概括复杂的前列腺微环境。此外,在体内环境中,对分化进行建模并不适合机械研究,因为它们很难操纵。因此,识别一个易于操作,但生理相关背景,研究分化是至关重要的。
前列腺器官模型代表一个优雅的前体环境,其中基底到发光分化报告发生。建立前列腺器官的方法已经建立良好14;但是,需要进一步优化这些方法。此外,收获和准备前列腺器官分析的方法没有明确描述。本文介绍了一种从小鼠前列腺分离到器官培养中分离的板前列腺上皮细胞的方法。这种方法使研究人员能够(1)防止在有机体形成期间发生2D菌落,(2)降低在介质补充过程中对基质凝胶的干扰风险,以及(3)更有效地计数有机体。此外,本手稿概述了用于制备西方印斑分析或全安装共聚焦显微镜的有机物的方法。重要的是,用于制备共聚焦显微镜的有机体的方法在持续时间内保持有机体的完整结构,从而减少图像采集前的器官损伤。总之,所述方法扩展了前列腺器官测定的能力。
值得注意的是,基底细胞和发光细胞的器官形成能力可以通过用于分离各自种群的方法和培养条件来改变。该测定中使用的有机体培养条件首先由卡特豪斯等人13描述。而卡特豪斯等人报告说,基底细胞具有较高的器官形成能力(15%)比发光细胞(1%)13,Chua等人,使用不同的分离方法和培养条件,报告发光细胞(0.2-0.3%)具有比基底细胞(0.03%)更高的器官形成能力20。总体而言,由卡特豪斯等人描述的方法导致基底细胞和发光细胞的有机体形成率较高,可能反映了用于分离基底细胞和发光细胞13的方法的差异,而不是偏向于从发光细胞形成有机体的培养条件。目前还不清楚本手稿中描述的协议是否有利于从多能发光祖(或承诺-发光前代)的发光器官形成9。虽然及时且成本高昂,但体内系谱追踪研究可用于验证与在有机体测定中阐明的独特的前列腺上皮谱相关的祖体特征。
发育、分化和转化等过程不仅与前列腺生物学相关,而且与包括脑、肺、肠、胰腺和肝脏在内的其他组织的生物学相关。所述方法有助于利用有机体模型来研究这些过程,不仅在前列腺,而且在广泛的组织。
The authors have nothing to disclose.
PDC 和 JMG 由露丝·基尔施斯坦国家研究服务奖 GM007185 提供支持。JAD由美国国家卫生研究院国家普通医学研究所(R25GM055052)资助,授予T.哈森和索尔·马丁内斯奖学金。ASG由斯皮策家庭基金会基金和吉尔基金会提供支持。这项工作得到了美国癌症协会(RSG-17-068-01-TBG)、国防部(W81XWH-13-1-0470)、玛格丽特E的支持。早期医学研究信托基金、NIH/NCI(P50CA092131/UCLA 前列腺癌 SPORE)、玫瑰山基金会,以及加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心、广泛干细胞研究中心、临床和转化科学研究所以及泌尿肿瘤学研究所的支持。
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |