הערמונית העכבר אורגנואידים לייצג הקשר מבטיח להעריך מנגנונים המסדירים בידול. המאמר מתאר גישה משופרת להקמת אורגנואידים הערמונית, ומציג שיטות (1) לאסוף חלבון ליפוסט מאורגנואידים, ו (2) לתקן וכתמי מיקרונואידים עבור מיקרוסקופ ההרכבה המלא.
אפיתל הערמונית מורכב בעיקר של תאים בסיס ולומיאל. במעקב vivo השושלת מנוצל כדי להגדיר את יכולת הבידול של העכבר בסיס הערמונית ותאים לומיאל במהלך פיתוח, רקמות התחדשות וטרנספורמציה. עם זאת, הערכת תאים פנימיים והרגולטורים חיצוניים של קיבולת בידול אפיתל הערמונית באמצעות גישה למעקב השושלת דורש לעתים קרובות הרבייה והוא יכול להיות מעולה. ב שיטת הערמונית אורגאיד, תאי בסיס ולומיאל ליצור אפיתל הערמונית לשעבר vivo. חשוב מכך, תאים אפיתל העיקרי יכול להיות מבודד עכברים של כל רקע גנטי או עכברים שטופלו עם מספר כלשהו של מולקולות קטנות לפני, או אחרי, ציפוי לתוך תלת מימדי (3D) תרבות. חומר מספיק להערכת קיבולת הבידול נוצר לאחר 7-10 ימים. אוסף של אורגנואידים בסיס ולומיאל נגזר (1) ניתוח חלבון על ידי אבן חשופה מערבית (2) אימונוהיסטוכימיה ניתוח של אורגנואידים שלמים על ידי מיקרוסקופ כל הר קונפוקלית וקד מאפשר לחוקרים להעריך את הvivo לשעבר הבידול קיבולת של תאים אפיתל הערמונית. כאשר נעשה שימוש בשילוב, שתי גישות אלה לספק מידע משלים על יכולת הבידול של בסיס הערמונית ותאי הלומיליים בתגובה גנטית או תרופתי מניפולציה.
בסיס ותאי לומיאל מהווים את רוב אפיתל הערמונית1. מחקרים שושלת היוחסין גילו כי סוגי תאים אלה הם בעיקר עצמית מתמשכת על ידי ושלתי נפרדות בעכבר למבוגרים2; עם זאת, הבדלה בידול מ בסיס ושלתי נצפתה בהקשרים מספר כולל פיתוח3,4, התחדשות רקמות5, דלקת6,7 ו סרטן הערמונית חניכה2,8. יתר על כן, הנתונים המתעוררים תומך הקיום של לומיאל רב עוצמה ושלתי, כמו גם לומיאל מחויבת ושלתי9. בסרטן הערמונית גרורתי, בידול מן השושלת לומיאל התלוי AR השושלת AR עם תכונות בסיס ונוירואנדוקרינים מייצגת מנגנון מוערך יותר ויותר של התנגדות מעכבי מסלול אנדרוגן10,11,12. לכן, כמו בידול מעורב בפיזיולוגיה נורמלי, החניכה סרטן התנגדות לטיפול, בהסבר הרגולטורים מולקולרית מפתח של בידול תא אפיתל הערמונית הוא קריטי.
מודל הערמונית מאורגאיד של העכבר התפתחה כהקשר אלגנטי לשעבר vivo ללמוד תא אפיתל הערמונית בידול9,13,14. באותו מבנה, תאים אפיתל בודדים מצופים לתוך מטריצה תלת-ממדית שבה הם יוצרים מבנים בלוטות המכילים הן תאים בסיס והן בתאי לומיאל בתוך שבוע 1. בעוד גישות קיימות לתאי ציפוי לתוך תרבות ארגונית ניתן להשתמש כדי לייצר ביעילות ארגונית, גישות אלה דורשות אופטימיזציה נוספת14. האתגרים הבולטים הקשורים עם מעצבי הערמונית culturing כוללים (1) למעט דו מימדי (2D) מושבות היוצרות מתחת מטריקס (ג’ל מטריצה) מן הניתוח, (2) שמירה על שלמות ג’ל מטריקס במהלך שינויי מדיה, ו (3) ספירת אורגנואידים במדויק. נייר זה מתווה גישה ליצור אורגנואידים מתאי אפיתל מבודדים מערמונית העכבר. הגישה המתוארת כרוכה בלוחות ציפוי עם פולי (2-הידרוקסיל מתיונין) (פולי-HEMA) כדי למנוע התרחשות של מושבות 2D. יתר על כן, תאים מצופים בטבעת ג’ל מטריצה, במקום דיסק ג’ל מטריצה, מה שהופך את המדיה ואת ספירת ארגונית פחות מאתגרת. טכניקות אלה לאפשר לחוקרים בקלות רבה יותר לחקור כיצד שינויים גנטיים או מולקולות קטנות הציג לפני, או במהלך, היווצרות אורגאיד לשנות תהליכים מפתח כגון בידול.
קציר של אורגנואידים הערמונית עבור כתמי מערבי או ניתוח אימונוהיסטוכיכימיים על ידי מיקרוסקופ ההרכבה מלאה מיקוד יכול לספק תובנה מכניסטית רבת ערך לתוך בידול13, אך היטב הקימו פרוטוקולים להכין אורגנואידים עבור טכניקות כאלה חסרות. כתב יד זה מתאר את הגישות לאורגנואידים של הקציר עבור אוסף של חלבון ליפוסט, או (2) קיבעון וכתמים למיקרוסקופיה קונפוקלית. חשוב מכך, הגישה המתוארת לתיקון וצביעת אורגנואידים של הערמונית שופרה במידה ניכרת ביחס לשיטות הקיימות. בעוד שאלה מסתמכים על הפחתת הארגון15, השיטה המתוארת בכתב יד זה מנצלת אורגנואידים שלמים, אשר מסייעת להגן מפני נזק אורגאיד במהלך הכנת המדגם. כאשר נעשה שימוש בשילוב, האבן החשופה והמיקרוסקופיה המערבית יכולים לספק תובנה רבת ערך לרגולטורים המולקולריים של בידול. לחילופין, ניתן להשתמש בגישות אלה כדי לעצב תהליכים אחרים כגון פיתוח וטרנספורמציה.
תא אפיתל הערמונית בידול כבר מעורב הן ביולוגיה הערמונית נורמלי2,3,4,5,6,7 ו ביולוגיה של המחלה8,10,11,12; עם זאת, הרגולטורים הראשיים של תהליך זה נותרים לא מוגדרים. זיהוי הרגולטורים מפתח של בידול תא אפיתל הערמונית היה קשה בחלק בשל העדר הקשרים הוקמה היטב כדי לדגמן אותו. בעוד תרבות דו-ממדית מונאולייר יכולה לשמש למודל בידול11,12, הקשר הזה לא מצליח ללכוד את הסביבה המורכבת ממיקרו הערמונית. יתר על כן, בהקשרים vivo למודל בידול לא להשאיל את עצמם למחקרים מכניסטיים, כפי שהם מאתגרים לתמרן. לכן, הזיהוי של קל לתמרן, אך מבחינה פיזיולוגית, ההקשר הרלבנטי, כדי ללמוד בידול הוא קריטי.
המודל של אורגנואיד הערמונית מייצג הקשר אלגנטי לשעבר vivo שבו בסיס בידול הלומיאל מדווח להתרחש. שיטות להקמת אורגנואידים הערמונית מבוססים היטב14; עם זאת, אופטימיזציה נוספת של שיטות אלה הוא הכרחי. יתר על כן, גישות הקציר והכנת אורגנואידים הערמונית לניתוח אינם מתוארים בבירור. מאמר זה מתאר גישה ללוח תאים אפיתל הערמונית מבודדים מערמונית העכבר לתוך התרבות האורגאידית. גישה זו מאפשרת לחוקרים (1) למנוע את התרחשות של מושבות 2D במהלך היווצרות אורגנואיד, (2) להפחית את הסיכון של הפרעה ג’ל מטריקס במהלך חידוש המדיה, ו (3) לספור אורגנואידים ביעילות רבה יותר. בנוסף, כתב היד הזה מתאר את הגישות לאורגנואידים הבציר לקראת ניתוח כתמי מערבי, או מיקרוסקופיה מלאה. וחשוב מכך, הגישה המשמשת להכנת אורגנואידים למיקרוסקופיה מחזיקה את המבנה השלם של האורגנואידים במשך הזמן, אשר מפחית את הנזק האורגאידית לפני רכישת התמונה. בסך הכל, הגישות המתוארות מרחיבות את היכולות של שיטת הערמונית.
בעיקר, היכולת להרכיב אורגאיד של תאים בסיס ולומיאל ניתן לשנות הן על ידי שיטות המשמשות כדי לבודד את האוכלוסיות המתאימות, ועל ידי תנאי התרבות. התנאים של התרבות הארגונית המשמשים באותה שיטת הפעולה תוארו לראשונה על ידי קרהאוס ואח ‘13. בעוד קרהאוס ואח ‘ דיווחו כי בתאי בסיס יש קיבולת היוצרים ארגונית גבוהה יותר (15%) מאשר תאי לומיאל (1%)13, צ’ואה et al., באמצעות שיטות בידוד נפרדות ותנאי תרבות, דיווחו כי תאי הלומיאל (0.2-0.3%) יש קיבולת ארגונית גבוהה יותר מאשר תאי בסיס (0.03%) באופן כללי, שיטות שתוארו על ידי Karthaus ואח ‘ להוביל שיעורי היוצרים גבוה יותר אורגאיד עבור תאים בסיס ולומיאל, כנראה הבדלים ההבדלים בגישה המשמש לבידוד תאים בסיס ולומיאל13, בניגוד לתנאי התרבות הטיה נגד היווצרות אורגאיד מתאי הלומיליים. זה לא ברור אם הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מעדיף היווצרות אורגאיד הלומיאלי מושלתי רב עוצמה, או מחויבת-לומינאל ושלתי9. למרות הזמן והעלות, במחקרים vivo שושלת היוחסין ניתן להשתמש כדי לאמת תכונות של מחולל קדמון הקשורים עם הערמונית שונים אפיתל ליננים באופן מובהר בתוך שיטת אורגנואיד.
תהליכים כגון פיתוח, בידול וטרנספורמציה אינם רלוונטיים רק לביולוגיה של הערמונית, אלא גם רלוונטית לביולוגיה של רקמות אחרות, כולל המוח, הריאות, המעי, הלבלב והכבד. השיטות המתוארות מקלות את הניצול של המודל האורגאיד לחקר תהליכים אלה לא רק את הערמונית, אלא גם מגוון רחב של רקמות.
The authors have nothing to disclose.
ה-PDC ו-JMG נתמכים על ידי פרס שירות המחקר הלאומי רות ל’ קירששטיין GM007185. ג’אד נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (R25GM055052) הוענק ל ט. חסון ולמלגות סול מרטינז. ASG נתמכת על ידי קרן משפחת שפיצר ואת קרן הגיל. עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-17-068-01-TBG), משרד ההגנה (W81XWH-13-1-0470), מרגרט E. מוקדם המחקר הרפואי אמון, NIH/NCI (P50CA092131/באוניברסיטת UCLA נבג בסרטן הערמונית), קרן רוז הילס, ותמיכה מרכז הסרטן של UCLA Jonsson, מרכז מחקר של תאי גזע רחב, מכון קליני וטרנסלtional המדע, והמכון לאונקולוגיה באורולוגית.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |