마우스 전립선 오르가노이드는 분화를 조절하는 메커니즘을 평가하는 유망한 맥락을 나타낸다. 이 논문은 전립선 오르가노이드를 확립하기 위한 개선된 접근법을 설명하고, (1) 오르가노이드로부터 단백질 용해액을 수집하고, (2) 전체 마운트 공초점 현미경검사법에 대한 수정 및 얼룩 오르가노이드를 수집하는 방법을 소개합니다.
전립선 상피는 기저 세포와 발광 세포의 우세하게 구성됩니다. 생체 내 계보 추적은 개발, 조직 재생 및 변형 동안 마우스 전립선 기저 및 발광 세포의 분화 능력을 정의하는 데 활용되어 왔다. 그러나, 계보 추적 접근법을 사용하여 전립선 상피 분화 용량의 세포 내재 및 외인성 조절제를 평가하는 것은 종종 광범위한 번식을 필요로 하며 비용 부담이 될 수 있다. 전립선 오르가노이드 분석에서, 기저 및 발광 세포는 전립선 상피 ex 생체를 생성한다. 중요하게도, 원발성 상피 세포는 임의의 유전적 배경또는 마우스의 마우스로부터 3차원(3D) 배양으로 도금되기 전이나 후에 임의의 수의 소분자로 치료된 마우스로부터 분리될 수 있다. 분화 능력의 평가를 위한 충분한 재료는 7-10일 후에 생성된다. (1) 웨스턴 블롯에 의한 단백질 분석및 (2) 전체 마운트 공초점 현미경으로 손상되지 않은 오르가노이드의 면역 조직 화학 적 분석을 위한 기저 유래 및 발광 유래 오르가노이드의 수집은 연구원이 생체 내 분화를 평가할 수 있게 합니다 전립선 상피 세포의 용량. 조합에서 사용될 때, 이 2개의 접근은 유전 또는 약리학 조작에 응하여 전립선 기저 및 발광 세포의 분화 능력에 관하여 상보적인 정보를 제공합니다.
기저 및 발광 세포는 전립선 상피1의대부분을 포함한다. 리니지 트레이싱 연구는 이러한 세포 유형이 성인 마우스2에서뚜렷한 선조에 의해 우세하게 지속된다는 것을 밝혔다; 그러나, 기저 전구체로부터의 발광 분화는 발달3,4,조직 재생5,염증6,7 및 전립선암 개시2,8을포함한 여러 맥락에서 관찰되었다. 더욱이, 신흥 데이터는 다능한 발광 선조뿐만 아니라 발광 에 전능한 선조9의존재를 지원합니다. 전이성 전립선암에서, AR 의존성 발광 계보로부터 기저 및 신경 내분비 기능을 가진 AR-무관심 혈통으로의 분화는 안드로겐 통로 억제제10,11,12에대한 내성의 점점 더 인정되는 메커니즘을 나타낸다. 따라서, 정상 생리학에서 분화가 연루됨에 따라, 암 개시 및 치료에 대한 내성, 전립선 상피 세포 분화의 주요 분자 조절기를 해명하는 것이 중요하다.
마우스 전립선 오르가노이드 모델은 전립선 상피 세포 분화를 연구하는 우아한 생체 내 문맥으로등장9,13,14. 이 분석에서, 개별 상피 세포는 1 주 안에 기저 세포와 발광 세포를 모두 포함하는 선 구조를 생성하는 3D 매트릭스로 도금됩니다. 오르가노이드 배양으로 세포를 도금하기 위한 기존 접근법은 오르가노이드를 효율적으로 생성하는 데 사용될 수 있지만, 이러한 접근법은 추가최적화(14)를필요로 한다. 전립선 오르가노이드 배양과 관련된 주목할 만한 과제는 (1) 분석으로부터 Matrigel(매트릭스 겔) 아래에 형성되는 2차원(2D) 콜로니를 제외하고, (2) 매질의 변화 동안 매트릭스 겔의 무결성을 유지하고, (3) 오르가노이드를 정확하게 계수하는 것을 포함한다. 이 논문은 마우스 전립선에서 분리된 상피 세포에서 오르가노이드를 생성하는 접근법을 간략하게 설명합니다. 설명된 접근법은 2D 콜로니의 발생을 방지하기 위해 폴리(2-하이드록세틸 메타크릴레이트)(Poly-HEMA)를 가진 코팅 판을 수반한다. 게다가, 세포는 매트릭스 젤 디스크보다는 매트릭스 젤 반지로 도금되고, 이는 매체를 바꾸고 오르가노이드를 세는 것을 덜 도전하게 합니다. 이 기술은 연구원이 어떻게 유전 변경 또는 작은 분자가 분화와 같은 중요한 프로세스를 바꾸기 전에, 또는 도중, 유기체 대형이 어떻게 소개되는지 더 쉽게 조사하는 것을 허용합니다.
전체 마운트 공초점 현미경 검사법에 의한 서쪽 얼룩 또는 면역 조직 화학 분석을 위한 전립선 오르가노이드의 수확은분화13에귀중한 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다, 그러나 그 같은 기술에 대한 오르가노이드를 준비하는 잘 확립된 프로토콜은 부족합니다. 이 원고는 (1) 단백질 용해물 또는 (2) 공초점 현미경 검사법에 대한 고정 및 염색에 대한 오르가노이드를 수확하는 방법을 설명합니다. 중요한 것은, 전립선 오르가노이드를 고정하고 염색하기 위해 기술된 접근법은 기존 방법과 관련하여 상당히 개선된다. 이들은 단면도 오르가노이드(15)에의존하는 동안, 이 원고에 기술된 방법은 견본 준비 도중 오르가노이드 손상으로부터 보호하는 것을 돕는 손상되지 않은 오르가노이드를 이용합니다. 조합에서 사용될 때, 서쪽 얼룩 및 공초점 현미경 검사법은 분화의 분자 조정기로 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또는 이러한 접근 방식을 사용하여 개발 및 변환과 같은 다른 프로세스를 모델링할 수 있습니다.
전립선 상피 세포 분화는 정상 전립선 생물학2,3,4,5,6,7 및 질병 생물학8,10,11,12모두에 연루되어 있다. 그러나 이 프로세스의 마스터 레귤레이터는 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 전립선 상피 세포 분화의 주요 조절기를 식별하는 것은 그것을 모델링하기 위하여 잘 확립된 문맥의 부재 때문에 부분적으로 어려웠습니다. 2D 단층 배양은 분화11,12를모델링하는데 사용될 수 있지만, 이러한 맥락은 복잡한 전립선 미세환경을 재화하지 못한다. 또한, 모델 차별화에 생체 내 컨텍스트는 조작하기 어렵기 때문에 기계론적 연구에 자신을 빌려주지 않습니다. 따라서, 조작하기 쉬운의 식별, 아직 생리학적으로 관련된 맥락, 분화를 연구하는 것은 중요하다.
전립선 오르가노이드 모델은 기저에서 발광 분화에 대한 기저체가 발생하는 우아한 생체 내 맥락을 나타낸다. 전립선 오르가노이드를 확립하는 방법은 잘 확립된 14; 그러나 이러한 메서드의 추가 최적화가 필요합니다. 또한 분석을 위해 전립선 오르가노이드를 수확하고 준비하는 접근법은 명확하게 설명되지 않습니다. 이 논문은 마우스 전립선에서 유기체 배양으로 분리된 판상피 세포에 대한 접근법을 설명합니다. 이 접근법은 (1) 오르가노이드 형성 동안 2D 콜로니의 발생을 방지하고, (2) 미디어 보충 동안 매트릭스 젤에 대한 중단의 위험을 감소시키고, (3) 오르가노이드를 보다 효과적으로 계산할 수 있게 한다. 또한,이 원고는 서양 얼룩 분석, 또는 전체 마운트 공초점 현미경 검사법에 대한 준비를위한 오르가노이드를 수확하는 접근 방식을 설명합니다. 중요한 것은, 공초점 현미경 검사법을 위한 오르가노이드를 준비하는 데 이용된 접근은 그것의 기간을 통해 오르가노이드의 손상의 본래 구조를 유지합니다, 이는 심상 취득의 앞에 오르가노이드 손상을 감소시킵니다. 전부, 기술된 접근은 전립선 오르가노이드 분석의 기능을 확장합니다.
특히, 기저 및 발광 세포의 오르가노이드 형성 능력은 각각의 인구를 격리하는 데 사용되는 방법, 및 배양 조건에 의해 모두 변경될 수 있습니다. 이 분석에서 사용된 오르가노이드 배양 조건은 카르타우스 외13에의해 처음 기술되었다. 카르타우스 외. 기저 세포는 더 높은 오르가노이드 형성 능력을 가지고 있다고보고 한 반면 (15%) 발광 세포(1%)13,Chua 등은 뚜렷한 절연 방법 및 배양 조건을 사용하여 발광 세포(0.2-0.3%)가 있다고 보고했습니다. 기저세포(0.03%)보다 오르가노이드 형성 능력이20%더 높다. 전반적으로, Karthaus 등. 에 의해 기술된 방법은 기저 및 발광 세포 둘 다를 위한 더 높은 organoid 형성 비율로 이끌어 내고, 아마 기저 및 발광 세포를 격리하기 위하여 이용된 접근에 있는 다름을반영합니다 13,발광 세포에서 organoid 대형에 대하여 편견하는 배양 조건과는 반대로. 이 원고에 기술된 프로토콜이 다능한 발광 선조또는 헌신적인 발광선조로부터의발광 오르가노이드 형성을 선호하는지 여부는 불분명합니다 9. 시기 와 비용 금지, 생체 내 계보 추적 연구는 유기 성 분석에서 해명 뚜렷한 전립선 상피 계보와 관련된 선조 기능을 검증하는 데 사용할 수 있습니다.
발달, 분화 및 변환과 같은 프로세스는 전립선 생물학과 관련이 없을 뿐만 아니라 뇌, 폐, 내장, 췌장 및 간을 포함한 다른 조직의 생물학과도 관련이 있습니다. 설명된 방법은 전립선뿐만 아니라 광범위한 조직에서 이러한 과정을 연구하기 위해 오르가노이드 모델의 활용을 용이하게합니다.
The authors have nothing to disclose.
PDC와 JMG는 루스 L. 커슈슈타인 국가 연구 서비스 상 GM007185에 의해 지원됩니다. JAD는 T. 하슨과 사울 마르티네즈 장학금에 수여 (R25GM055052)의 국립 국립 연구소의 일반 의학 연구소에 의해 지원됩니다. ASG는 스피처 가족 재단 기금과 길 엔다우먼트의 지원을 받고 있습니다. 이 작품은 미국 암 학회 (RSG-17-068-01-TBG), 국방부 (W81XWH-13-1-0470), 마가렛 E에 의해 지원되었다. 초기 의학 연구 신탁, NIH/NCI (전립선암의 P50CA092131/UCLA SPORE), 로즈 힐스 재단, UCLA의 존슨 종합 암 센터, 브로드 줄기 세포 연구 센터, 임상 및 중개 과학 연구소 및 비뇨기과 종양학 연구소의 지원.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |