Les organoïdes de prostate de souris représentent un contexte prometteur pour évaluer des mécanismes qui règlent la différenciation. Cet article décrit une approche améliorée pour établir des organoïdes de prostate, et introduit des méthodes pour (1) recueillir le lysate de protéine des organoïdes, et (2) fixer et tacher des organoïdes pour la microscopie confocale de monture entière.
L’épithélium de la prostate est composé principalement de cellules basales et lumineuses. Le tracé in vivo de lignée a été utilisé pour définir la capacité de différenciation des cellules basales et lumineuses de prostate de souris pendant le développement, la régénération de tissu et la transformation. Cependant, l’évaluation des régulateurs cellulaires et extrinsèques de la capacité de différenciation épithéliale de la prostate à l’aide d’une approche de traçage de lignée nécessite souvent une reproduction intensive et peut être prohibitive sur le plan des coûts. Dans l’analyse organoïde de prostate, les cellules basales et lumineuses génèrent l’épithélium prostatique ex vivo. Fait important, les cellules épithéliales primaires peuvent être isolées de souris de tout milieu génétique ou de souris traitées avec un certain nombre de petites molécules avant ou après, le placage dans la culture tridimensionnelle (3D). Le matériel suffisant pour l’évaluation de la capacité de différenciation est produit après 7-10 jours. La collecte d’organoïdes basaux et d’organoïdes d’origine luminale pour (1) l’analyse des protéines par western blot et (2) l’analyse immunohistochimique des organoïdes intacts par microscopie confocale à monture entière permet aux chercheurs d’évaluer la différenciation ex vivo capacité des cellules épithéliales de prostate. Lorsqu’elles sont utilisées en combinaison, ces deux approches fournissent des informations complémentaires sur la capacité de différenciation des cellules basales et lumineuses de la prostate en réponse à la manipulation génétique ou pharmacologique.
Les cellules basiques et lumineuses constituent la majorité de l’épithélium de la prostate1. Les études de traçage de lignée ont indiqué que ces types de cellules sont principalement auto-soutenus par des progéniteurs distincts dans la souris adulte2; cependant, la différenciation luminale des progéniteurs basaux a été observée dans plusieurs contextes comprenant le développement3,4, régénération de tissu5, inflammation6,7 et initiation de cancer de la prostate2,8. En outre, les données émergentes soutiennent l’existence d’ancêtres luminaires multipotents ainsi que d’ancêtres luminairesengagés 9. Dans le cancer de la prostate métastatique, la différenciation d’une lignée luminal AR-dépendante à une lignée AR-indifférente avec des dispositifs basal et neuroendocrines représente un mécanisme de plus en plus apprécié de résistance aux inhibiteurs de voie d’androgène10,11,12. Par conséquent, comme la différenciation est impliquée dans la physiologie normale, l’initiation du cancer et la résistance à la thérapie, il est essentiel d’élucider les principaux régulateurs moléculaires de la différenciation épithéliale des cellules de la prostate.
Le modèle organoïde de prostate de souris a émergé comme contexte ex vivo élégant pour étudier la différenciation épithéliale de cellulesdeprostate 9,13,14. Dans cet analyse, les cellules épithéliales individuelles sont plaquées dans une matrice 3D où elles génèrent des structures glandulaires contenant des cellules basales et luminales dans un délai de 1 semaine. Bien que les approches existantes pour placage des cellules dans la culture organoïde puissent être utilisées pour générer efficacement des organoïdes, ces approches nécessitent une optimisation plus poussée14. Les défis notables liés à la culture des organoïdes de la prostate comprennent (1) l’exclusion des colonies bidimensionnelles (2D) qui se forment sous le Matrigel (gel de matrice) de l’analyse, (2) le maintien de l’intégrité du gel de matrice pendant les changements de médias, et (3) le comptage des organoïdes avec précision. Cet article décrit une approche pour produire des organoïdes à partir de cellules épithéliales isolées de la prostate de souris. L’approche décrite consiste en plaques de revêtement avec du méthacrylate poly(2-hydroxyethyl) (Poly-HEMA) pour empêcher l’apparition de colonies 2D. En outre, les cellules sont plaquées dans un anneau de gel de matrice, plutôt qu’un disque de gel de matrice, qui rend le changement du support et le comptage des organoïdes moins provocants. Ces techniques permettent aux chercheurs d’étudier plus facilement comment les altérations génétiques ou les petites molécules introduites avant ou pendant la formation d’organoïdes modifient les processus clés tels que la différenciation.
La récolte des organoïdes de prostate pour l’analyse occidentale de tache ou immunohistochemical par la microscopie confocale de monture entière peut fournir la perspicacité mécaniste valable dans la différenciation13,pourtant des protocoles bien établis pour préparer des organoïdes pour de telles techniques manquent. Ce manuscrit décrit les approches de la récolte des organoïdes pour (1) la collecte de lysate protéique, ou (2) la fixation et la coloration pour la microscopie confocale. Fait important, l’approche décrite pour fixer et tacher les organoïdes de la prostate est considérablement améliorée par rapport aux méthodes existantes. Bien que ceux-ci reposent sur la section des organoïdes15, la méthode décrite dans ce manuscrit utilise des organoïdes intacts, ce qui aide à protéger contre les dommages organoïdes pendant la préparation de l’échantillon. Lorsqu’il est utilisé en combinaison, western blot et microscopie confocale peut fournir un aperçu précieux dans les régulateurs moléculaires de la différenciation. Alternativement, ces approches peuvent être utilisées pour modéliser d’autres processus tels que le développement et la transformation.
La différenciation épithéliale de cellules de prostate a été impliquée dans la biologienormale de prostate2,3,4,5,6,7 et la biologie de la maladie 8,10,11,12; toutefois, les principaux régulateurs de ce processus ne sont toujours pas définis. L’identification des régulateurs clés de la différenciation épithéliale de cellules de prostate a été difficile en partie due à l’absence de contextes bien établis pour la modeler. Tandis que la culture 2D de monocouche peut être employée pour modéliser la différenciation11,12,ce contexte ne récapitule pas le microenvironnement complexe de prostate. En outre, les contextes in vivo pour modéliser la différenciation ne se prêtent pas aux études mécanistes, car ils sont difficiles à manipuler. Par conséquent, l’identification d’un contexte facile à manipuler, mais physiologiquement pertinent, pour étudier la différenciation est essentielle.
Le modèle organoïde de prostate représente un contexte ex vivo élégant où la différenciation basale à luminal est rapportée pour se produire. Les méthodes d’établissement des organoïdes de la prostate sont bien établies14; cependant, une optimisation plus poussée de ces méthodes est nécessaire. En outre, les approches de récolte et de préparation des organoïdes de la prostate pour l’analyse ne sont pas clairement décrites. Cet article décrit une approche aux cellules épithéliales de prostate de plaque isolées de la prostate de souris dans la culture organoïde. Cette approche permet aux chercheurs (1) de prévenir l’apparition de colonies 2D pendant la formation d’organoïdes, (2) de réduire le risque de perturbation du gel de matrice pendant le réapprovisionnement des médias, et (3) de compter plus efficacement les organoïdes. En outre, ce manuscrit décrit les approches de la récolte des organoïdes pour la préparation à l’analyse de tache occidentale, ou microscopie confocale de montage entier. Fait important, l’approche utilisée pour préparer les organoïdes pour la microscopie confocale maintient la structure intacte des organoïdes tout au long de sa durée, ce qui réduit les dommages organoïdes avant l’acquisition de l’image. Au total, les approches décrites augmentent les capacités de l’organe de la prostate.
Notamment, la capacité de formation d’organoïdes des cellules basales et lumineuses peut être modifiée à la fois par des méthodes utilisées pour isoler les populations respectives, et par les conditions de culture. Les conditions de culture organoïde utilisées dans cet essais ont d’abord été décrites par Karthaus et al.13. Alors que Karthaus et coll. ont signalé que les cellules basales ont une capacité de formation organoïde plus élevée (15 %) que les cellules luminales (1 %)13, Chua et coll., en utilisant des méthodes d’isolement distinctes et des conditions de culture, ont signalé que les cellules luminales (0,2-0,3 %) ont une capacité de formation d’organoïdes plus élevée que les cellules basales (0,03 %)20. Dans l’ensemble, les méthodes décrites par Karthaus et coll. conduisent à des taux de formation d’organoïdes plus élevés pour les cellules basales et lumineuses, reflétant probablement les différences dans l’approche utilisée pour isoler les cellules basales et lumineuses13, par opposition aux conditions de culture qui biaisent la formation d’organoïdes à partir de cellules lumineuses. Il n’est pas clair si le protocole décrit dans ce manuscrit favorise la formation d’organoïdes luminal à partir d’ancêtres sommaux multipotents, ou d’ancêtres lumineux commis9. Bien que opportune et coût-prohibitive, les études in vivo de traçage de lignée peuvent être employées pour valider des dispositifs d’ancêtre liés aux lignées épithéliales distinctes de prostate élucidées dans l’analyse organoïde.
Des processus tels que le développement, la différenciation et la transformation sont non seulement pertinents pour la biologie de la prostate, mais aussi pour la biologie d’autres tissus, y compris le cerveau, les poumons, l’intestin, le pancréas et le foie. Les méthodes décrites facilitent l’utilisation du modèle organoïde pour étudier ces processus non seulement dans la prostate, mais aussi dans un large éventail de tissus.
The authors have nothing to disclose.
PDC et JMG sont soutenus par le Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD est soutenu par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (R25GM055052) décerné à T. Hasson et la bourse Saul Martinez. ASG est soutenu par le Spitzer Family Foundation Fund et le Gill Endowment. Ce travail a été soutenu par l’American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), le ministère de la Défense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Early Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE in Prostate Cancer), Rose Hills Foundation, et le soutien du Jonsson Comprehensive Cancer Center de l’UCLA, du Broad Stem Cell Research Center, du Clinical and Translational Science Institute et de l’Institute of Urologic Oncology.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |