تحليل استقلاب الخلايا الجذعية للدم
Summary
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSPCs) الانتقال من حاله هادئه إلى حاله التمايز بسبب اللدونة الايضيه اثناء تشكيل الدم. هنا ، نقدم طريقه الأمثل لقياس التنفس الميتوكوندريا وتحلل من HSPCs.
Abstract
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSPCs) لديها اللدونة الايضيه المتميزة ، والتي تسمح لهم بالانتقال من حالتهم الهادئة إلى حاله التمايز للحفاظ علي متطلبات تشكيل الدم. ومع ذلك ، كان من الصعب تحليل الوضع الأيضي (التنفس الميتوكوندريا وتحلل) من HSPCs بسبب اعدادهم المحدودة وعدم وجود بروتوكولات الأمثل لغير ملتصقة ، HSPCs الهشة. هنا ، ونحن نقدم مجموعه من واضحة ، خطوه بخطوه تعليمات لقياس التنفس الأيضي (معدل استهلاك الأكسجين. OCR) وتحلل الخلايا (معدل تحمض خارج الخلية ؛ ECAR) من murine نخاع العظم سلالهnegSca1 +c-كيت + (lsk) hspcs. يوفر هذا البروتوكول كميه أكبر من HSK من نخاع العظم murine ، ويحسن من صلاحيه HSPCs اثناء الحضانة ، ويسهل تحليلات تدفق خارج الخلية من HSPCs غير ملتصقة ، ويوفر بروتوكولات الحقن الأمثل (التركيز والوقت) للادويه التي تستهدف الاكسده ومسارات غليكولتيك. هذا الأسلوب يتيح التنبؤ بالحالة الايضيه وصحة HSPCs اثناء نمو الدم والامراض.
Introduction
منذ عمر معظم خلايا الدم الناضجة قصيرة ، والتوازن من الدم يعتمد علي التجديد الذاتي والتمايز من السكان الذين عاشوا لفتره طويلة ولكنها نادره من الخلايا الجذعية للدم (HSPCs)1. HSPCs هي هادئه ، ولكنها سريعة للانتشار والخضوع التمايز علي التحفيز للحفاظ علي متطلبات نظام الدم. كما كل الدولة الخلوية HSPC يتطلب الطلب حيوية فريدة من نوعها ، والتغيرات الايضيه هي المحركات الرئيسية للقرارات مصير HSPC. ولذلك ، فان فقدان اللدونة الايضيه ، عن طريق تغيير التوازن بين السكون ، والتجديد الذاتي ، والتمايز من HSPCs ، وغالبا ما يؤدي إلى الاضطرابات التكاثرية myelo أو اللمفاوية. معا, فهم التنظيم الأيضي للتنمية hspc أمر بالغ الاهميه للكشف عن أليات الكامنة وراء الأورام الخبيثة الدموية2,3,4,5.
توليد التنفس المتقدريه وتحلل الجلوكوز تولد ATP لدفع ردود الفعل داخل الخلايا وإنتاج كتل البناء اللازمة لتوليف جزيء. منذ HSPCs لديها كتله الميتوكوندريا منخفضه مقارنه بالخلايا المتمايزة6 وانها تحافظ علي الهدوء في منافذ نخاع العظم نقص الأكسجين ، hspcs تعتمد في المقام الأول علي تحلل الجلوكوز. تنشيط HSPCs يعزز الأيض الميتوكوندريا التي تؤدي إلى فقدان الهدوء ودخولها اللاحقة في دوره الخلية. هذه اللدونة الايضيه من hspcs يسمح للحفاظ علي تجمع hspc في جميع انحاء البالغين الحياة6،7،8،9،10،11،12. ولذلك ، فمن الاهميه بمكان التحقيق في أنشطتها الايضيه ، مثل معدل استهلاك الأكسجين (OCR ؛ مؤشر فوسفولات الاكسده) ومعدل تحمض خارج الخلية (ECAR ؛ مؤشر تحلل الجلوكوز) لتحليل تنشيط HSPC والحالة الصحية. ويمكن قياس كل من OCR و ECAR في وقت واحد ، في الزمن الحقيقي ، وذلك باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. ومع ذلك ، يتطلب الأسلوب الحالي اعداد كبيره من الخلايا وهو الأمثل للخلايا الملتصقة13. منذ HSPCs لا يمكن عزل بكميات كبيره من الفئران14، تتطلب الفرز للحصول علي السكان النقي ، هي الخلايا غير ملتصقة15، ولا يمكن ان يكون مثقفا بين عشيه وضحيها دون تجنب التمايز16، فقد كان من الصعب قياس OCR و ecar من hspcs. هنا ، ونحن نقدم مجموعه من واضحة ، خطوه بخطوه تعليمات لمرافقه الدروس المستندة إلى الفيديو علي كيفيه قياس التنفس الأيضي وتحلل من بضعة آلاف murine نخاع العظم النسبnegSca1 +c-كيت + (lsk) hspcs.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، ونحن نظهر العزلة من الحد الأقصى لكميه نقيه وقابله للحياة murine LSK HSPCs السكان ، فضلا عن قياس تحللها والتنفس الميتوكوندريا مع محلل تدفق خارج الخلية. وعلي وجه التحديد ، يتغلب البروتوكول علي المسائل التقنية التالية لاستخدام النظام الخاص ب LSK HSPCs: ط) التردد المنخفض LSK HSPCs في نخاع العظم murine<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل جزئيا الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (HL131645 ، CA016058) ، ومؤسسه سانت بالدريك ، ومؤسسه بيلوفونيا.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
