Summary

Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.

Abstract

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) hanno una plasticità metabolica distinta, che permette loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste della formazione del sangue. Tuttavia, è stato difficile analizzare lo stato metabolico (respirazione mitocondriale e glicolisi) degli HSPC a causa del loro numero limitato e della mancanza di protocolli ottimizzati per HSPC fragili e non aderenti. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per misurare la respirazione metabolica (tasso di consumo di ossigeno; OCR) e glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare; ECAR) di HSPC di midollo osseo murino-Lingo Questo protocollo fornisce una maggiore quantità di HSPC LSK dal midollo osseo murino, migliora la vitalità degli HSPC durante l’incubazione, facilita l’analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce protocolli di iniezione ottimizzati (concentrazione e tempo) per i farmaci che prendono di mira il fosforolazione ossidativa e le vie glicolytiche. Questo metodo consente la previsione dello stato metabolico e della salute degli HPC durante lo sviluppo del sangue e le malattie.

Introduction

Poiché la durata della vita della maggior parte delle cellule del sangue mature è breve, l’omeostasi del sangue si basa sull’auto-rinnovamento e la differenziazione di una popolazione longeva ma rara di cellule staminali ematopoietiche (HSPN)1. Gli HSPC sono quiescenti, ma sono pronti a proliferare e a subire differenziazione sulla stimolazione per sostenere le esigenze del sistema sanguigno. Poiché ogni stato cellulare HSPC richiede una domanda bioenergetica unica, i cambiamenti metabolici sono i fattori chiave delle decisioni del destino HSPC. Pertanto, la perdita di plasticità metabolica, alterando l’equilibrio tra quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione degli HPG, porta spesso a disturbi mielo- o linfo-proliferativi. Insieme, la comprensione della regolazione metabolica dello sviluppo HSPC è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle neoplasie ematologiche2,3,4,5.

La respirazione mitocondriale e la glicolisi generano ATP per guidare reazioni intracellulari e produrre gli elementi costitutivi necessari per la sintesi delle macromolecole. Poiché gli HSPC hanno una bassa massa mitocondriale rispetto alle cellule differenziate6 e sostengono la quiescenza nelle nicchie ipossiche del midollo osseo, gli HSPC si basano principalmente sulla glicolisi. L’attivazione di HSPC migliora il loro metabolismo mitocondriale che porta alla perdita di quiescenza e la loro successiva immissione nel ciclo cellulare. Tale plasticità metabolica degli HSPN consente la manutenzione del pool HSPC per tutta la vita adulta6,7,8,9,10,11,12. Pertanto, è fondamentale studiare le loro attività metaboliche, come il tasso di consumo di ossigeno (OCR; indice di fosforo ossidativo) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR; indice della glicolisi) per analizzare l’attivazione di HSPC e lo stato di salute. Sia l’OCR che l’ECAR possono essere misurati simultaneamente, in tempo reale, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tuttavia, il metodo corrente richiede un numero elevato di celle ed è ottimizzato per le celle aderenti13. Poiché gli HSPC non possono essere isolati in grandi quantità dai topi14, richiedono lo smistamento per ottenere una popolazione pura, sono cellule non aderenti15e non possono essere coltivate durante la notte senza evitare la differenziazione16, è stato difficile misurare l’OCR e l’ECAR degli HSPC. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video-based tutorial su come misurare la respirazione metabolica e la glicolisi di poche migliaia di murine osso midollo-LineagenegSca1c-Kit(LSK) HSPC.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato nazionale per la cura e l’uso degli animali dell’ospedale pediatrico (IACUC). NOT:</ Il protocollo è descritto in ordine cronologico che si estende per il periodo di due giorni. Utilizzare nuovi reagenti come descritto nel protocollo riportato di seguito. 1. Preparazione del reagenti il giorno precedente al test Idratare la cartuccia del sensore. Incubare …

Representative Results

Il nostro metodo di estrazione ci ha permesso di raccogliere fino a 80.000 HSPC LSK per mouse. La vitalità e il numero di cellule LSK sono stati migliorati con il nostro metodo, perché noi: (1) combinato midollo osseo da arti superiori e inferiori, ossa dell’anca, sterno, gabbia toracica, e la colonna vertebrale, (2) evitato utilizzando buffer di lisi a cellule rosse che avrebbe aumentato la morte delle cellule e l’agglomeramento, (3) utilizzato il gradiente di densità media separazione delle cellule mono-nucleate, e …

Discussion

Qui, dimostriamo l’isolamento di una quantità massima di popolazione di HSPC murini murini puro e vitale, nonché la misurazione della loro glicolisi e della respirazione mitocondriale con un analizzatore di flusso extracellulare. In particolare, il protocollo supera i seguenti problemi tecnici per l’uso di HSPC LSK : i) la bassa frequenza degli HSPC LSK nel midollo osseo murino14, ii) bassa attività metabolica basale di LSK HSPCs26, iii) la fragilità di LSK HSPCs<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è in parte supportato dal sostegno finanziatorio dei National Institutes of Health (HL131645, CA016058), dalla Fondazione St. Baldrick e dalla Pelotonia Foundation.

Materials

0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

References

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Cite This Article
Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

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