Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels
Summary
Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.
Abstract
Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) haben eine ausgeprägte metabolische Plastizität, die es ihnen ermöglicht, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen der Blutbildung aufrechtzuerhalten. Allerdings war es schwierig, den metabolischen Zustand (mitochondriale Atmung und Glykolyse) von HSPCs aufgrund ihrer begrenzten Anzahl und des Fehlens optimierter Protokolle für nicht-haftige, zerbrechliche HSPCs zu analysieren. Hier stellen wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Messung der metabolischen Atmung (Sauerstoffverbrauchsrate; OCR) und Glykolyse (extrazelluläre Versauerungsrate; ECAR) von murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Dieses Protokoll bietet eine höhere Menge an LSK-HSPCs aus murinen Knochenmark, verbessert die Lebensfähigkeit von HSPCs während der Inkubation, erleichtert extrazelluläre Flussanalysen von nicht-haftenden HSPCs und bietet optimierte Injektionsprotokolle (Konzentration und Zeit) für Medikamente, die auf oxidative Phosphorylierung und glykolytische Pfade abzielen. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage des Stoffwechselzustands und der Gesundheit von HSPCs während der Blutentwicklung und Krankheiten.
Introduction
Da die Lebensdauer der meisten reifen Blutkörperchen kurz ist, beruht die Homöostase des Blutes auf der Selbsterneuerung und Differenzierung einer langlebigen, aber seltenen Population hämatopoetischer Stammzellen (HSPCs)1. HSPCs sind still, aber sie sind schnell zu vermehren und unterziehen Differenzierung auf Stimulation, um die Anforderungen des Blutsystems zu erhalten. Da jeder HSPC-Zellzustand eine einzigartige bioenergetische Nachfrage erfordert, sind die metabolischen Veränderungen die wichtigsten Treiber von HSPC-Schicksalsentscheidungen. Daher führt der Verlust der metabolischen Plastizität, indem das Gleichgewicht zwischen Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs verändert wird, oft zu myelo- oder lympho-proliferativen Störungen. Zusammen ist das Verständnis der metabolischen Regulation der HSPC-Entwicklung entscheidend, um Mechanismen aufzudecken, die hämatologischen Malignitäten2,3,4,5zugrunde liegen.
Mitochondriale Atmung und Glykolyse erzeugen ATP, um intrazelluläre Reaktionen anzutreiben und die für die Makromolekülsynthese notwendigen Bausteine zu produzieren. Da HSPCs im Vergleich zu differenzierten Zellen6 eine niedrige mitochondriale Masse haben und in hypoxischen Knochenmarknischen Ruhe halten, setzen HSPCs in erster Linie auf Glykolyse. Die Aktivierung von HSPCs verbessert ihren mitochondrialen Stoffwechsel, der zum Verlust der Ruhe und ihrem anschließenden Eintritt in den Zellzyklus führt. Eine solche metabolische Plastizität von HSPCs ermöglicht die Aufrechterhaltung des HSPC-Pools während des gesamten Erwachsenenlebens6,7,8,9,10,11,12. Daher ist es wichtig, ihre metabolischen Aktivitäten zu untersuchen, wie die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR; Index der oxidativen Phosphorylierung) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR; Index der Glykolyse), um die HSPC-Aktivierung und den Gesundheitszustand zu analysieren. Sowohl die OCR als auch die ECAR können gleichzeitig in Echtzeit mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen werden. Die aktuelle Methode erfordert jedoch eine große Anzahl von Zellen und ist für anhimierende Zellen13optimiert. Da HSPCs nicht in großen Mengen von Mäusen isoliert werden können14, eine Sortierung erfordern, um eine reine Population zu erhalten, sind nicht-anhantibe Zellen15, und kann nicht über Nacht kultiviert werden, ohne Differenzierung zu vermeiden16, war es schwierig, die OCR und die ECAR von HSPCs zu messen. Hier bieten wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen, um videobasierte Tutorials zu begleiten, wie man metabolische Atmung und Glykolyse von einigen tausend murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs misst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir die Isolierung einer maximalen Menge an reiner und lebensfähiger muriner LSK HSPCs Population sowie die Messung ihrer Glykolyse und mitochondrialen Atmung mit einem extrazellulären Flussanalysator. Insbesondere überwindet das Protokoll die folgenden technischen Probleme für die Verwendung von LSK HSPCs: i) die niedrige Frequenz von LSK HSPCs im murinen Knochenmark14, ii) niedrige basale metabolische Aktivität von LSK HSPCs26, iii) die Fragilität von LS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird zum Teil durch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health (HL131645, CA016058), der St. Baldrick es Foundation und der Pelotonia Foundation unterstützt.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
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