Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato
Summary
Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.
Abstract
Os mioblastos preliminares são precursores proliferating indiferenciados do músculo esqueletal. Eles podem ser cultivados e estudados como precursores musculares ou induzidos a se diferenciar em estágios posteriores do desenvolvimento muscular. O protocolo fornecido aqui descreve um método robusto para o isolamento e a cultura de uma população altamente proliferativa de células mioblastos de explantes de músculo esquelético do rato adulto jovem. Estas pilhas são úteis para o estudo das propriedades metabólicas do músculo esqueletal de modelos diferentes do rato, assim como em outras aplicações a jusante tais como o transfection com ADN exógeno ou a transdução com vetores da expressão viral. O nível de diferenciação e perfil metabólico dessas células depende do comprimento da exposição e da composição dos meios utilizados para induzir a diferenciação mioblástica. Estes métodos fornecem um sistema robusto para o estudo do metabolismo de células musculares do rato ex vivo. É importante ressaltar que, diferentemente dos modelos in vivo, os métodos aqui descritos fornecem uma população celular que pode ser expandida e estudada com altos níveis de reprodutibilidade.
Introduction
Embora muitas vezes citado como uma indicação de saúde metabólica global, vários estudos mostraram que o índice de massa corporal (IMC) em idosos não está consistentemente associado com maior risco de mortalidade. Até o momento, o único fator que se mostrou consistente com a redução da mortalidade nessa população é o aumento da massa muscular1. O tecido muscular representa uma das maiores fontes de células sensíveis à insulina no corpo e, portanto, é crítico na manutenção da homeostase metabólica geral2. A ativação do tecido do músculo esqueletal através do exercício é associada com os aumentos na sensibilidade de insulin local e na saúde metabólica total3. Enquanto os modelos in vivo são essenciais para estudar a fisiologia muscular e o impacto da função muscular no metabolismo integrado, as culturas primárias dos miotubos fornecem um sistema tratável que reduz a complexidade dos estudos em animais.
Os mioblastos derivados de músculos pós-natais podem ser usados para estudar o impacto de inúmeras condições de tratamento e crescimento de forma altamente reprodutível. Isto tem sido reconhecido por muito tempo e diversos métodos para o isolamento e a cultura do mioblastos foram descritos4,5,6,7,8,9. Alguns destes métodos utilizam os músculos Neonatais e produzem números relativamente baixos de mioblastos,8,necessitando de vários animais para estudos de maior escala. Além disso, os métodos mais utilizados para a cultura de mioblasts usam “Pré-chapeamento” para enriquecer para os mioblastos, que são menos aderentes do que outros tipos de células. Nós encontramos o método alternativo do enriquecimento descrito aqui para ser muito mais eficiente e reprodutível para enriquecer uma população altamente proliferative do mioblastos. Em resumo, este protocolo permite o isolamento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares jovens adultos, através de conseqüência em meios de cultura. Myoblasts pode ser colhido repetidamente, sobre diversos dias, expandido ràpida, e induzido para diferenciar-se em myotubes. Este protocolo gera de forma revisível um grande número de células de mioblastos saudáveis que se diferenciam de forma robusta em miotubos espontâneamente espasmos. Nos permitiu estudar o metabolismo e os ritmos circadianos em miotubos primários de camundongos de uma variedade de genótipos. Finalmente, incluímos métodos para a preparação de miotubos para o estudo do metabolismo oxidativo, utilizando medições de taxas de consumo de oxigênio em placas de 96 poços.
Protocol
Representative Results
Discussion
O músculo esquelético é vital para o estabelecimento e manutenção da homeostase metabólica11. O estudo da fisiologia muscular é complicado pela variabilidade interindividual, bem como dificuldade na obtenção de amostras, particularmente no caso de estudos humanos. Os miotubos preliminares cultivados foram mostrados para recapitular muitas características da fisiologia do músculo, incluindo a homeostase12do cálcio, regeneração do tecido danificado<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos ao Dr. Matthew Watt na Universidade de Melbourne e Dr. Anastasia Kralli na Universidade Johns Hopkins para assistência adotando este protocolo com base no trabalho de Mokbel et al.6. Agradecemos também ao Dr. Sabine Jordan a ajuda para desenvolver e adotar este protocolo em nosso laboratório. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde R01s DK097164 e DK112927 para K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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