العزلة والتمايز من المقاطع الاساسيه من الماوس الهيكل العظمي العضلات الشرح
Summary
وتنتشر الخلايا السلائف التي تفرق لتشكيل myotubes بولينوتيد وألياف عضلية في نهاية المطاف الهيكل العظمي العضلات. هنا ، نقدم بروتوكولا للعزل الفعال وثقافة العضلات الاوليه من عضلات الماوس الكبار الشباب الهيكل العظمي. وتتيح هذه الطريقة الدراسات الجزيئية والجينية والايضيه لخلايا العضلات في الثقافة.
Abstract
العضلات الاوليه هي السلائف التكاثر غير متمايزة للعضلات الهيكل العظمي. ويمكن زراعتها ودراستها كسلائف العضلات أو المستحثة للتمييز في مراحل لاحقه من تطور العضلات. البروتوكول المقدم هنا يصف طريقه قويه للعزل والثقافة من السكان التكاثري للغاية من خلايا ميوبلاست من الشباب الكبار الفار العضلات الهيكل العظمي الشرح. هذه الخلايا هي مفيده لدراسة الخصائص الايضيه للعضلات الهيكل العظمي من نماذج الماوس المختلفة ، وكذلك في التطبيقات المصب الأخرى مثل التحول مع الحمض النووي الخارجية أو محول مع ناقلات التعبير الفيروسي. مستوي التمايز والتمثيل الأيضي لهذه الخلايا يعتمد علي طول التعرض ، وتكوين وسائل الاعلام المستخدمة للحث علي التمايز ميوبلاست. توفر هذه الطرق نظام قوي لدراسة الخلية العضلية الماوس التمثيل الغذائي السابق الجسم الحيوي. الأهم من ذلك ، علي عكس النماذج المجرية ، توفر الطرق الموصوفة هنا عدد الخلايا التي يمكن توسيعها ودراستها مع مستويات عاليه من الاستنساخ.
Introduction
في حين غالبا ما يستشهد كمؤشر علي الصحة الايضيه الشاملة, وقد أظهرت دراسات متعددة ان مؤشر كتله الجسم (BMI) في كبار السن لا يرتبط باستمرار مع ارتفاع خطر الوفاات. حتى الآن ، والعامل الوحيد الذي يظهر ان تكون متسقة مع انخفاض معدل الوفاات في هذه الفئة السكانية زيادة كتله العضلات1. الانسجه العضلية تمثل واحده من أكبر مصادر الخلايا الحساسة للانسولين في الجسم ، التالي حاسمه في الحفاظ علي التوازن الأيضي العام2. ويرتبط تفعيل انسجه العضلات الهيكل العظمي عن طريق ممارسه الزيادات في كل من حساسية الانسولين المحلية والصحة الايضيه العامة3. بينما في النماذج المجرية ضرورية لدراسة فسيولوجيا العضلات وتاثير وظيفة العضلات علي الأيض المتكاملة, الثقافات الاوليه من myotubes توفير نظام عريكة التي تقلل من تعقيد الدراسات الحيوانية.
يمكن استخدام العضلات المستمدة من عضلات ما بعد الولادة لدراسة تاثير العديد من ظروف العلاج والنمو بطريقه قابله للتكرار بشكل كبير. وقد تم الاعتراف بهذا منذ فتره طويلة وتم وصف عده طرق للعزل والثقافة ميوبلاست4,5,6,7,8,9. بعض هذه الطرق استخدام عضلات حديثي الولادة وتسفر عن اعداد منخفضه نسبيا من المقاطعات5,8, تتطلب العديد من الماشية للدراسات علي نطاق أوسع. أيضا ، تستخدم الطرق الأكثر استخداما لزراعه المقاطع العضلية “ما قبل الطلاء” لإثراء المقاطع العضلية ، التي هي اقل تمسكا من أنواع الخلايا الأخرى. وقد وجدنا ان طريقه الإثراء البديلة الموصوفة هنا لتكون أكثر كفاءه واستنساخا لإثراء السكان الميبلاست التكاثريين. وباختصار ، فان هذا البروتوكول يمكن عزل المقاطع العضلية التكاثرية العالية من الشباب البالغين من العضلات المفسرة ، عبر النمو في وسائل الاعلام الثقافية. يمكن حصاد المقاطع العضلية بشكل متكرر ، علي مدي عده أيام ، وتوسيعها بسرعة ، والتي تحفز علي التفريق في myotubes. هذا البروتوكول التكرار يولد عددا كبيرا من خلايا ميوبلاست صحية التي تفرق بقوة في الوخز التلقائي myotubes. وقد مكنتنا من دراسة الأيض وإيقاعات الايقاعيه في myotubes الابتدائية من الفئران من مجموعه متنوعة من الأنماط الجينية. وأخيرا ، ونحن تشمل أساليب لاعداد myotubes لدراسة الأيض التاكسدي ، وذلك باستخدام قياسات معدلات استهلاك الأوكسجين في لوحات 96-بئر.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهيكل العظمي العضلات أمر حيوي لإنشاء وصيانة التوازن الأيضي11. وتعقد دراسة فسيولوجيا العضلات من خلال التباين بين الافراد, فضلا عن صعوبة في الحصول علي عينات, لا سيما في حاله الدراسات البشرية. وقد تبين myotubes الابتدائية مثقف لتلخيص العديد من الميزات من فسيولوجيا العضلات, بما في ذل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب صاحبا البلاغ عن امتنانهما للدكتور ماثيو وات في جامعه ملبورن والدكتورة اناستاسيا كرالي في جامعه جونز هوبكنز للمساعدة في اعتماد هذا البروتوكول استنادا إلى عمل موبيل وآخرون6. كما نشكر الدكتورة سابين جوردان علي مساعدتها في تطوير واعتماد هذا البروتوكول في مختبرنا. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01s DK097164 و DK112927 إلى K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
