마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화
Summary
근세포는 다핵근화 된 myotubes를 형성하고 결국 골격 근섬유를 형성하기 위해 분화 전구세포를 증식시. 여기에서, 우리는 젊은 성인 마우스 골격 근육에서 1 차적인 근분의 능률적인 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배양에서 근육 세포의 분자, 유전 및 대사 연구를 가능하게합니다.
Abstract
1 차 근세포는 골격 근의 미분화 증식 선구자입니다. 그들은 배양 하 고 근육 선구자로 공부 하거나 근육 개발의 나중 단계로 분화 유도 수 있습니다. 여기에 제공된 프로토콜은 젊은 성인 마우스 골격 근 이식으로부터 의 골수 세포집단의 고도로 증식성 집단의 격리 및 배양에 대한 강력한 방법을 설명한다. 이들 세포는 다른 마우스 모델의 골격 근의 대사 특성의 연구뿐만 아니라 바이러스 발현 벡터를 가진 외인성 DNA 또는 형질전환과 같은 다른 다운스트림 응용 분야에서 유용하다. 이들 세포의 분화 및 대사 프로필의 수준은 근구 분화를 유도하는 데 사용되는 매체의 노출 길이 및 조성에 따라 달라집니다. 이들 방법은 마우스 근육 세포 대사 엑생체의 연구를 위한 견고한 시스템을 제공한다. 중요한 것은, 생체 내 모델과는 달리, 여기에 기술된 방법은 높은 수준의 재현성으로 확장되고 연구될 수 있는 세포 집단을 제공한다.
Introduction
종종 전반적인 신진 대사 건강의 표시로 인용 하는 동안, 여러 연구 는 체 질량 지 수 (BMI) 노인에서 일관 되 게 사망의 높은 위험과 관련 되지 않습니다. 현재까지, 이 인구에 있는 감소된 사망률과 일치하는 것으로 나타난 유일한 요인은 증가된 근육 질량1. 근육 조직은 신체에서 인슐린에 민감한 세포의 가장 큰 공급원 중 하나를 나타내며, 따라서 전반적인 대사 항상성의 유지에 중요합니다2. 운동을 통한 골격근 조직의 활성화는 국소 인슐린 감수성 및 전반적인 대사 건강 의 증가와 관련이있다 3. 생체 내 모델은 근육 생리학과 통합 신진 대사에 대한 근육 기능의 영향을 연구하는 데 필수적이지만, myotube의 기본 문화는 동물 연구의 복잡성을 줄이는 견인 시스템을 제공합니다.
산후 근육에서 파생된 근세포는 매우 재현가능한 방식으로 수많은 치료 및 성장 조건의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 오랫동안 인식되어 왔으며 근강초 격리 및 문화에 대한 여러 가지 방법이4,5,6,7,8,9로설명되어 왔다. 이러한 방법 중 일부는 신생아 근육을 사용하고 더 큰 규모의 연구를 위해 여러 동물을 필요로하는 근체5,8의상대적으로 낮은 숫자를 산출합니다. 또한, 근세포를 배양하기 위한 가장 널리 사용되는 방법은 다른 세포 유형보다 덜 부착된 근세포를 풍부하게 하기 위해 “사전 도금”을 사용합니다. 우리는 고도로 증식하는 근강군을 풍부하게 하기 위한 훨씬 더 효율적이고 재현성이 있는 것으로 여기에서 기술된 대체 농축 방법을 발견했습니다. 요약하면,이 프로토콜은 젊은 성인 근육 이식에서 고도로 증식성 근종의 격리를 가능하게, 문화 매체로 의자 성장을 통해. 근체는 며칠에 걸쳐 반복적으로 수확되고, 급속히 확장되고, myotube로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 이 프로토콜은 자발적으로 경련하는 myotubes로 강력하게 분화하는 많은 수의 건강한 근세포 세포를 재현가능하게 생성합니다. 그것은 우리가 다양한 유전자형의 마우스의 기본 myotube에서 신진 대사와 circadian 리듬을 연구할 수 있게 했습니다. 마지막으로, 우리는 96 웰 플레이트에서 산소 소비율의 측정을 사용하여 산화 물질 대사의 연구를 위한 myotubes를 준비하는 방법을 포함합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골격 근은 대사 항상성의 설립 및 유지보수에 필수적입니다11. 근육 생리학의 연구는 개별적인 가변성에 의해 복잡합니다, 뿐만 아니라 견본을 얻기에 있는 어려움, 특히 인간 적인 연구 결과의 경우에. 배양된 1차 묘튜브는 칼슘 항상성12,손상된 근육 조직 재생5,운동에 대한 반응으로 대사 변경13,및 근육 생리학의 많은 특징?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 멜버른 대학의 매튜 와트 박사와 존스 홉킨스 대학의 아나스타샤 크랄리 박사에게 목벨 등의 작업을 기반으로이 프로토콜을 채택하는 데 도움을 주셔서 감사합니다6. 우리는 또한 우리의 실험실에서이 프로토콜을 개발하고 채택하는 데 도움을 준 Sabine Jordan 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 K.A.L에 건강 R01s DK097164 및 DK112927의 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
