Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Summary

I mioblasti stanno proliferando cellule precursori che si differenziano per formare miotubi polinucleati e infine mitole muscolari scheletriche. Qui, presentiamo un protocollo per un isolamento efficiente e la cultura dei mioblasti primari dai muscoli scheletrici dei topi giovani adulti. Il metodo consente studi molecolari, genetici e metabolici delle cellule muscolari in coltura.

Abstract

I mioblasti primari sono precursori indifferenziati della proliferazione del muscolo scheletrico. Possono essere coltivati e studiati come precursori muscolari o indotti a differenziarsi nelle fasi successive dello sviluppo muscolare. Il protocollo qui fornito descrive un metodo robusto per l’isolamento e la coltura di una popolazione altamente prolifera di cellule mioblaste da espeamanti muscolari scheletrici di topi giovani adulti. Queste cellule sono utili per lo studio delle proprietà metaboliche del muscolo scheletrico di diversi modelli murini, così come in altre applicazioni a valle come la trasfezione con DNA esogeno o la trasduzione con vettori di espressione virale. Il livello di differenziazione e profilo metabolico di queste cellule dipende dalla durata dell’esposizione e dalla composizione dei supporti utilizzati per indurre la differenziazione del mioblasto. Questi metodi forniscono un sistema robusto per lo studio del metabolismo delle cellule muscolari del topo ex vivo. È importante sottolineare che, a differenza dei modelli in vivo, i metodi qui descritti forniscono una popolazione cellulare che può essere ampliata e studiata con alti livelli di riproducibilità.

Introduction

Mentre spesso citato come un’indicazione della salute metabolica generale, più studi hanno dimostrato che l’indice di massa corporea (BMI) negli adulti più anziani non è costantemente associato con un rischio più elevato di mortalità. Ad oggi, l’unico fattore dimostrato di essere coerente con la mortalità ridotta in questa popolazione è l’aumento della massa muscolare¹. Il tessuto muscolare rappresenta una delle più grandi fonti di cellule sensibili all’insulina nel corpo, ed è quindi fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi metabolica complessiva². L’attivazione del tessuto muscolare scheletrico tramite esercizio fisico è associata ad aumenti sia nella sensibilità all’insulina locale che nella salute metabolica generale³. Mentre i modelli in vivo sono essenziali per studiare la fisiologia muscolare e l’impatto della funzione muscolare sul metabolismo integrato, le colture primarie dei miotubi forniscono un sistema trattabile che riduce la complessità degli studi sugli animali.

I mioblasti derivati dai muscoli post-natali possono essere utilizzati per studiare l’impatto di numerose condizioni di trattamento e crescita in modo altamente riproducibile. Questo è stato a lungo riconosciuto e diversi metodi per l’isolamento del mioblasto e la cultura sono stati descritti^4,5,6,7,8^,9. Alcuni di questi metodi utilizzano muscoli neoiatali e producono un numero relativamente basso di mioblasti^5,8, che richiedono diversi animali per studi su larga scala. Inoltre, i metodi più diffusi per coltivare i mioblasti utilizzano il “pre-placcatura” per arricchire per i mioblasti, che sono meno aderenti rispetto ad altri tipi di cellule. Abbiamo trovato il metodo di arricchimento alternativo descritto qui per essere molto più efficiente e riproducibile per arricchire una popolazione di mioblasti altamente proliferante. In sintesi, questo protocollo consente l’isolamento dei mioblasti altamente proliferanti dagli espianti muscolari giovani adulti, attraverso l’escrescenza in mezzi di coltura. I mioblasti possono essere raccolti ripetutamente, per diversi giorni, rapidamente espansi e indotti a differenziarsi in miotubi. Questo protocollo genera riproducibilmente un gran numero di cellule mioblaste sane che si differenziano robustamente in miotubi spontaneamente contraenti. Ci ha permesso di studiare il metabolismo e i ritmi circadiani nei miotubi primari di topi di una varietà di genotipi. Infine, includiamo metodi per preparare miotubi per lo studio del metabolismo ossidativo, utilizzando misurazioni dei tassi di consumo di ossigeno in piastre 96-well.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di Scripps Research. 1. Raccolta e trattamento di espiante di tessuto muscolare Il giorno prima della dissezione, sterilizzare tutte le attrezzature di dissezione (forza, lame di rasoio e forbici) e preparare tutti i supporti necessari: fosfato bufferizzato salina (PBS), MB Plating media (12,5 mL di DMEM, 12,5 mL di HAMS F12, 20 mL di bovini siero (FBS), 5 mL di integratore medio liquido amniotico), e soluzione di rives…

Representative Results

La sezione 1 del protocollo fornito dovrebbe produrre cellule primarie che emergono dagli espianti che saranno visibili al microscopio luminoso standard (Figura 2). Una popolazione cellulare eterogenea sarà visto crescere da e circondare ogni espianto di tessuto muscolare. I mioblasti appariranno come piccole sfere rotonde e luminose. Seguendo la Sezione 2 del protocollo produrrà raccolti precoci di mioblasti da espianti tissutali, che conterranno poche cel…

Discussion

Il muscolo scheletrico è vitale per l’istituzione e il mantenimento dell’omeostasi metabolica¹¹. Lo studio della fisiologia muscolare è complicato dalla variabilità interindividuale, così come la difficoltà nell’ottenere campioni, in particolare nel caso di studi umani. Miotubes primari coltivati hanno dimostrato di ricapitolare molte caratteristiche della fisiologia muscolare, tra cui l’omeostasi di calcio¹², rigenerazione del tessuto muscolare danneggiato<sup class="…

Materials

Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum	Sigma	H1138	1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Other Materials:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps	Any
Razor Blades	Any
Scissors	Any
Whatman paper	VWR	21427-648
60 mm plate	VWR	734-2318
10 cm plate	VWR	25382-428 (CS)
T25 Flasks	ThermoFisher	156367
T75 Flasks	ThermoFisher	156499
Centrifuge Tubes (15mL)	BioPioneer	CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid	Sigma	P5585-10G	for measurement of fatty acid oxidation
carnitine	Sigma	C0283-5G	for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir	Sigma	E1905	for measurement of fatty acid oxidation
BSA	Sigma	A7030	used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation