Summary

Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

Published: October 15, 2019
doi:

Summary

Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.

Abstract

Primaire myoblasten zijn niet-gedifferentieerde prolifererende precursoren van skeletspieren. Ze kunnen worden gekweekt en bestudeerd als spier precursoren of geïnduceerd om te differentiëren in latere stadia van spierontwikkeling. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een robuuste methode voor de isolatie en cultuur van een zeer proliferatieve populatie van Myoblast cellen van jonge volwassen muis skeletspieren explanten. Deze cellen zijn nuttig voor de studie van de metabolische eigenschappen van de skeletspieren van verschillende muismodellen, evenals in andere downstream toepassingen zoals transfectie met exogene DNA of transductie met virale expressie vectoren. Het niveau van differentiatie en metabole Profiel van deze cellen is afhankelijk van de lengte van de blootstelling, en de samenstelling van de media die worden gebruikt voor het opwekken van Myoblast differentiatie. Deze methoden bieden een robuust systeem voor de studie van muis spiercellen metabolisme ex vivo. Belangrijk is dat, in tegenstelling tot in vivo-modellen, de hier beschreven methoden zorgen voor een celpopulatie die kan worden uitgebreid en bestudeerd met hoge reproduceerbaarheids niveaus.

Introduction

Hoewel vaak aangehaald als een indicatie van de algehele metabole gezondheid, meerdere studies hebben aangetoond dat body mass index (BMI) bij oudere volwassenen is niet consistent geassocieerd met een hoger risico van sterfte. Tot op heden is de enige factor die consistent is met verminderde sterfte in deze populatie toegenomen spier massa1. Spierweefsel vertegenwoordigt een van de grootste bronnen van insuline-gevoelige cellen in het lichaam, en is daarom kritisch in het onderhoud van de totale metabole homeostase2. Activering van skeletspier weefsel via oefening wordt geassocieerd met stijgingen van zowel de lokale insulinegevoeligheid en de algehele metabole gezondheid3. Terwijl in vivo modellen zijn essentieel voor het bestuderen van de spier fysiologie en de impact van de spierfunctie op geïntegreerde metabolisme, primaire culturen van myotubes bieden een Tractable systeem dat de complexiteit van dierproeven vermindert.

Myoblasten afgeleid van postnatale spieren kunnen worden gebruikt om de impact van talrijke behandelings-en groeicondities op een zeer reproduceerbare manier te bestuderen. Dit is al lang erkend en verschillende methoden voor Myoblast isolatie en cultuur zijn beschreven4,5,6,7,8,9. Sommige van deze methoden gebruiken neonatale spieren en leveren relatief lage aantallen myoblasten op,5,8, waarvoor meerdere dieren nodig zijn voor grootschalig onderzoek. Ook de meest gebruikte methoden voor het kweken van myoblasten gebruiken “pre-plating” om te verrijken voor myoblasten, die minder hecht zijn dan andere celtypen. We hebben geconstateerd dat de alternatieve verrijkings methode die hier wordt beschreven veel efficiënter en reproduceerbaar is voor het verrijken van een zeer proliferatieve Myoblast populatie. Samengevat, dit protocol maakt de isolatie van zeer proliferatieve myoblasten van jonge volwassen spier Explants, via uitgroei in cultuur media. Myoblasten kunnen herhaaldelijk worden geoogst, gedurende meerdere dagen, snel uitgebreid, en geïnduceerd om te differentiëren in myotubes. Dit protocol reproduceerd genereert een groot aantal gezonde Myoblast cellen die krachtig differentiëren in spontaan trekkingen myotubes. Het heeft ons in staat om metabolisme en circadiane ritmes te bestuderen in primaire myotubes van muizen van een verscheidenheid van genotypes. Tot slot, we omvatten methoden voor de voorbereiding van myotubes voor de studie van oxidatieve metabolisme, met behulp van metingen van de zuurstofverbruik in 96-goed platen.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van Scripps onderzoek. 1. inzameling en verwerking van spierweefsel Explants De dag voorafgaand aan de sectie, Steriliseer alle dissectie apparatuur (Tang, scheermesjes en schaar) en bereid alle benodigde media: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), MB plating media (12,5 mL DMEM, 12,5 mL hammen F12, 20 mL van warmte-geïnactiveerde foetale runderen serum (FBS), 5 mL amniotische vloeistof medium supplement), en coating oplossing…

Representative Results

In de volgende sectie 1 van het opgegeven protocol moeten primaire cellen worden bereikt die uit de explantaten komen die zichtbaar zullen zijn onder een standaard lichtmicroscoop (Figuur 2). Er zal een heterogene celpopulatie worden gezien die groeit uit en rond elke spierweefsel explant. Myoblasten zullen verschijnen als kleine, ronde, heldere bollen. Na deel 2 van het Protocol zullen vroege oogsten van myoblasten uit weefsel Explants opleveren, die weinig …

Discussion

Skeletspieren is van vitaal belang voor de oprichting en het onderhoud van metabole homeostase11. De studie van spier fysiologie is gecompliceerd door interindividuele variabiliteit, evenals moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, met name in het geval van menselijke studies. Gekweekte primaire myotubes is aangetoond dat het even vele kenmerken van spier fysiologie, met inbegrip van calcium homeostase12, regeneratie van beschadigde spierweefsel5</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn dankbaar voor Dr. Matthew watt aan de Universiteit van Melbourne en Dr. Anastasia Kralli aan de Johns Hopkins University voor hulp bij de aanneming van dit protocol op basis van het werk van Mokbel et al.6. We danken Dr. Sabine Jordan ook voor hulp bij het ontwikkelen en aannemen van dit protocol in ons laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health R01s DK097164 en DK112927 tot K.A.L.

Materials

Coating Solution:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen Life Technologies A1064401 1.7 mL
Matrigel Fisher CB40234A 1 mL
Plating Media:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS Life Technologies 16000044 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax Life Technologies 12556023 5 mL
Myoblast Media:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS Life Technologies 16000044 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax Life Technologies 12556023 5 mL
Differentiation Media:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum Sigma H1138 1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin Life Technologies 41400045 0.5 mL
Other Materials:
PBS Gibco 14040133
Gentamicin Sigma G1397
TrypLE Gibco 12604013
DMSO Sigma 472301 Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps Any
Razor Blades Any
Scissors Any
Whatman paper VWR 21427-648
60 mm plate VWR 734-2318
10 cm plate VWR 25382-428 (CS)
T25 Flasks ThermoFisher 156367
T75 Flasks ThermoFisher 156499
Centrifuge Tubes (15mL) BioPioneer CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Seahorse XFe96 Analyzer Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate Agilent 102720-100 components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid Sigma P5585-10G for measurement of fatty acid oxidation
carnitine Sigma C0283-5G for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir Sigma E1905 for measurement of fatty acid oxidation
BSA Sigma A7030 used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation

References

  1. Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
  2. Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
  3. Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
  4. Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
  5. Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
  6. Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
  7. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  8. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  9. Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
  10. Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
  11. Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
  12. Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
  13. Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
  14. Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
  15. Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
  16. Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
  17. Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
  18. Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).

Play Video

Cite This Article
Vaughan, M., Lamia, K. A. Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants. J. Vis. Exp. (152), e60310, doi:10.3791/60310 (2019).

View Video