Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer

Summary

Mycobacterium tuberculosis montre une augmentation de la production et la libération de vésicules extracellulaires en réponse à de faibles conditions de fer. Ce travail détaille un protocole pour générer de faibles conditions de fer et des méthodes pour la purification et la caractérisation des vésicules extracellulaires mycobactériennes libérées en réponse à une carence en fer.

Abstract

Les mycobactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent causal de la tuberculose humaine, libèrent naturellement des vésicules extracellulaires (VE) contenant des molécules immunologiquement actives. Les connaissances concernant les mécanismes moléculaires de la biogenèse vésicule, le contenu des vésicules et leurs fonctions à l’interface pathogène-hôte sont très limitées. Pour répondre à ces questions, il faut des procédures rigoureuses d’isolement, de purification et de validation des véhicules électriques. Auparavant, la production de vésicules s’est avérée améliorée lorsque M. tuberculosis a été exposé à la restriction de fer, une condition rencontrée par Mtb dans l’environnement hôte. Présenté ici est un protocole complet et détaillé pour isoler et purifier les véhicules électriques à partir de mycobactéries déficientes en fer. Des méthodes quantitatives et qualitatives sont appliquées pour valider les véhicules électriques purifiés.

Introduction

Les vésicules extracellulaires mycobactériennes (MEV) sont des nanoparticules membranaires, de 60 à 300 nm de taille, naturellement libérées par les mycobactéries à croissance rapide et lente¹. Les MEV libérés par les mycobactéries pathogènes constituent un mécanisme d’interaction avec l’hôte par l’intermédiaire de protéines immunologiquement actives, lipides et glycolipides sécrétés d’une manière concentrée et protégée^2,3,4. Pour caractériser les Monos et comprendre leur biogenèse et leurs fonctions, des méthodes strictes et efficaces de purification et de validation des vésicules sont cruciales. Jusqu’à présent, les MEV ont été isolés des filtrates de culture des mycobactéries cultivées dans un milieu riche en fer^1,5,6,7^,8.

Cependant, des travaux antérieurs ont démontré que la limitation du fer stimule grandement la libération de vésicule dans Mtb, peut-être pour capturer le fer par l’intermédiaire de la mycobactine, un siderophore sécrété dans meVs⁹. Bien que des procédures d’isolement des MVE par rapport à la culture Mtb dans un milieu de fer élevé aient été décrites, une méthodologie efficace pour obtenir des MPV à partir de cultures de fer faible n’a pas été signalée. Par conséquent, l’objectif de cette méthode est d’isoler, purifier et quantifier les Monovirus obtenus à partir de cultures de fer faible afin qu’ils puissent être utilisés pour des essais biochimiques et fonctionnels et pour l’analyse des déterminants génétiques de la production de vésicules chez les mycobactéries.

Protocol

1. Préparation du milieu défini appauvri en fer Préparer 1 L de milieu minimal (MM) en dissolvant 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 ml de glycérol et 2 g de dextrose dans 900 ml d’eau deionisée dans un récipient en plastique. Évitez le verre pour prévenir la contamination du fer. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 N NaOH et le volume à 1 L avec de l’eau. Ajouter 50 g de résine de chélage métallique (MCR) et agiter doucement à l’aide d’une barre magnétique pendant 24 h…

Representative Results

Les Monospaces ont été purifiés par sédimentation différentielle dans un gradient de densité (Figure 1, Figure 2). Dans les conditions décrites, les MEV se sont séparés principalement en fraction de gradient 3 (F3), ce qui correspond à 25% d’iodixanol. Cette conclusion est basée sur la détection de protéines, de lipides membranaires, de visualisation microscopique de Monomètres intacts, de distribution de la taille …

Discussion

Plusieurs méthodes pour purifier les exosomes eucaryotes dérivés de cellules ont été développées¹². En revanche, il existe peu d’informations sur les méthodes efficaces pour purifier les véhicules électriques dérivés de bactéries⁷. L’isolement efficace des véhicules électriques dérivés de Mtb doit tenir compte des difficultés intrinsèques à cultiver ce mycobactérie pathogène. Mtb a un temps de division long (24 h) et doit être manipulé dans des condi…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit