Summary

العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

المتفطره السليه تظهر زيادة إنتاج وإطلاق الحويصلات خارج الخلية استجابه لظروف الحديد المنخفضة. هذا العمل تفاصيل بروتوكول لتوليد الشروط والأساليب منخفضه الحديد لتنقيه وتوصيف الحويصلات المتفطرات خارج الخلية التي صدرت استجابه لنقص الحديد.

Abstract

البكتيريا الفطرية ، بما في ذلك المتفطره السل (Mtb) ، العامل المسبب للسل البشري ، وبطبيعة الشكل الإفراج عن الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) التي تحتوي علي جزيئات نشطه من الناحية المناعية. المعرفة بشان أليات الجزيئية لتكوين الخلايا الحيوية ، ومحتوي الحويصلات ، ووظائفها في واجهه الممرض والمضيف محدوده جدا. ويتطلب التصدي لهذه المسائل إجراءات صارمة للعزل والتنقية والتحقق من صحة المركبات. في السابق ، تم العثور علي إنتاج حويصلة لتعزيز عندما تعرض m. السل لتقييد الحديد ، وهي حاله واجهتها Mtb في البيئة المضيفة. يقدم هنا بروتوكول كامل ومفصل لعزل وتنقيه المركبات الخاصة من المتفطره التي تعاني من نقص الحديد. يتم تطبيق الطرق الكمية والنوعية للتحقق من صحة المركبات الكترونيه المنقية.

Introduction

المتفطرات الحويصلات الخارجة عن الخلية (الميمياس) هي جسيمات نانويه مرتبطة بالغشاء ، 60 − 300 نانومتر في الحجم ، والتي يطلقها بشكل طبيعي المتفطره السريعة والبطيءه النمو1. ميقاف التي أطلقتها المتفطره المسببة للامراض تشكل اليه للتفاعل مع المضيف عن طريق البروتينات النشطة مناعيا ، والدهون ، و جليكوليبيد يفرز في طريقه مركزه ومحمية2،3،4. لتوصيف المولود وفهم تكوينه الحيوي ووظائفه ، فان الطرق الصارمة والفعالة لتنقيه الحويصلة والتحقق منها حاسمه. حتى الآن ، تم عزل المولودين من الترشيحات الثقافية من المتفطره المزروعة في وسط غني بالحديد1،5،6،7،8.

ومع ذلك ، أظهرت الاعمال السابقة ان الحد من الحديد يحفز إلى حد كبير الإفراج عن حويصلة في Mtb ، ربما للتقاط الحديد عن طريق المتفابط ، وهو فلكي يفرز في ميسيس9. وعلي الرغم من ان إجراءات عزل المولود من Mtb المستزرعة في وسط الحديد العالي قد وصفت ، فانه لم يتم الإبلاغ عن منهجيه فعاله للحصول علي المولودين من ثقافات الحديد المنخفضة. ولذلك ، فان الهدف من هذه الطريقة هو عزل وتنقيه وقياس الميس التي تم الحصول عليها من ثقافات الحديد المنخفضة بحيث يمكن استخدامها لاختبارات الكيمياء الحيوية والوظيفية ولتحليل المحددات الوراثية لإنتاج حويصلة في المتفطره.

Protocol

1. اعداد الحديد المنضب المتوسطة المحددة اعداد 1 لتر من الحد الأدنى المتوسطة (مم) عن طريق تذويب 5 غرام من KH2بو4، 5 غرام من L-اسباراجين ، 20 مل من الجلسرين ، و 2 غرام من سكر العنب في 900 مل من الماء منزوع الأيونات في وعاء من البلاستيك. تجنب الزجاج لمنع تلوث الحديد. ضبط درجه الحموضة إلى …

Representative Results

تم تنقيه الميس بواسطة الترسب التفاضلي في تدرج الكثافة (الشكل 1، الشكل 2). وببموجب الشروط الموصوفة ، يفصل المولود في الغالب في الجزء المتدرج 3 (F3) ، الذي يقابل 25 في المائة إيوديكسانول. ويستند هذا الاستنتاج علي الكشف عن البروتين ، والدهون الغشا…

Discussion

وقد تم تطوير أساليب متعددة لتنقيه الخلايا المشتقة النواة الخلوية12. وعلي النقيض من ذلك ، هناك معلومات محدوده عن الطرق الفعالة لتنقيه البكتيريا المشتقة من المركبات7. العزلة الفعالة للمركبات المركبة التي تستمد من Mtb تحتاج إلى النظر في الصعوبات المتاصله في زراعه هذه…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لرافائيل برادوس-روساليس لتقاسم antisera مضاده MEV و Navneet Dogra لأداء تحليل تتبع جسيمات متناهي.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

View Video