Summary

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

Published: October 31, 2019
doi:

Summary

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

Abstract

בקטריה, כולל שחפת של פטרת (Mtb), הסוכן סיבתי של שחפת האדם, שחרור באופן טבעי ושלפוחיות (EVs) המכיל מולקולות פעילות חיסונית. ידע בנוגע למנגנון המולקולרי של שלפוחית הביוגנזה, התוכן של שלפוחיות, והתפקודים שלהם בממשק מארח הפתוגן הוא מאוד מוגבל. טיפול בשאלות אלה דורש הליכים קפדניים לבידוד, טיהור ואימות של EVs. בעבר, הפקת שלפוחית הייצור היתה משופרת כאשר M. שחפת נחשף הגבלה ברזל, מצב שנתקל Mtb בסביבה המארחת. מוצג כאן הוא פרוטוקול מלא ומפורט כדי לבודד ולטהר EVs מן הברזל מלקוי של ברזל. שיטות כמותיים ואיכותניות מוחלות על אימות EVs מטוהרים.

Introduction

מסחטות של פטרת שלפוחיות (MEVs) הם חלקיקים מאוגדים קרום, 60-300 ננומטר בגודל, באופן טבעי שוחרר על ידי מהיר-ו-לאט גדל בקטריה מפטרת1. Mevs שוחרר על ידי חיידקים פתוגניים מהווים מנגנון לאינטראקציה עם המארח באמצעות חלבונים פעילים חיסוני, שומנים, ו גליקולפידים מופרש באופן מרוכז ומוגן2,3,4. כדי לאפיין MEVs ולהבין הביוגנזה שלהם פונקציות, שיטות קפדניות ויעילות של שלפוחית השמש והאימות הם קריטיים. עד כה, mevs מבודדים מן filtrates תרבות של פטרת גדל בינוני עשיר ברזל1,5,6,7,8.

עם זאת, העבודה הקודמת הוכיחה כי מגבלת ברזל מעוררת במידה רבה שחרור שלפוחית ב Mtb, אולי כדי ללכוד ברזל דרך פטרת, siderophore מופרש MEVs9. למרות ההליכים עבור MEVs בידוד מ Mtb תרבותי בינוני ברזל גבוה תוארו, מתודולוגיה יעילה להשיג MEVs מתרבויות ברזל נמוך לא דווחו. לכן, המטרה של שיטה זו היא לבודד, לטהר, ולכמת mevs שהתקבלו מתרבויות ברזל נמוך, כך שהם יכולים לשמש עבור בחני הביוכימי ופונקציונלי לניתוח של דטרמיניזם גנטי של ייצור שלפוחית לפוחית ב בקטריה.

Protocol

1. הכנת ברזל מוגדר מידי המדיום להכין 1 L של בינונית מינימלית (MM) על ידי המסת 5 גרם של KH2PO4, 5 g של L-אספרגין, 20 מ ל של גליצרול, ו 2 גרם של דקסטרוז ב 900 ml של מים מוהים במיכל פלסטיק. להימנע זכוכית כדי למנוע זיהום ברזל. כוונן את ה-pH ל 6.8 עם 5 N NaOH ונפח ל 1 L עם מים. הוסף 50 g של שרף מתכת הכלף (M…

Representative Results

MEVs היו מטוהרים על ידי משקעי שיפוע דיפרנציאלי במילוי צפיפות (איור 1, איור 2). תחת התנאים שתוארו, MEVs מופרדים בעיקר השבר הדרגתי 3 (F3), אשר מתאים 25% יודיקסנול. מסקנה זו מבוססת על זיהוי חלבון, השומנים הממברנה, ויזואליזציה מיקרוסקופיים של MEVs שלמים, הת…

Discussion

שיטות מרובות כדי לטהר תא איקריוטית הנגזרות המפותחות התפתחו12. לעומת זאת, יש מידע מוגבל על שיטות יעילות כדי לטהר חיידקים נגזר EVs7. בידוד יעיל של Mtb נגזר EVs צריך לשקול את הקשיים הפנימיים בגידול זה פטרת הפתוגני. Mtb יש זמן חלוקה ארוכה (~ 24 שעות) ויש לטפל ברמת בטיחות שלושה (BSL…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה לרפאל prados-rosales עבור שיתוף anti-mev קטריולוגיה ו navneet dogra לביצוע ניתוח מעקב ננו-חלקיק.

Materials

Amicon stirred cell Model 108 EMD Milipore UFSC40001 Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes Fisher 05-538-61 Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane EMD Milipore PBHK07610 Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin Bio-Rad 142-2842 Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar BD Difco 262710 Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth BD Difco 271310 Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane GE Healthcare 10600001 Blotting Membrane
Optiprep Sigma D1556 Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm Beckman Coulter 355618 Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm Beckman Coulter 344059 Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye BioRad 5000006 Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby Molecular Probes S12000 Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH Molecular Probes T204 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks CellPro V50022 Filter Unit

References

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (152), e60359, doi:10.3791/60359 (2019).

View Video