鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け
Summary
結核菌は、低鉄条件に応答して細胞外小胞の産生および放出の増加を示す。本研究では、鉄欠乏症に反応して放出されるマイコバクテリア細胞外小胞の精製および特性評価のための低鉄条件および特性評価のための方法を生成するためのプロトコルを詳しく説明する。
Abstract
ヒト結核の原因物質である結核菌(Mtb)を含む抗酸菌は、免疫学的に活性な分子を含む細胞外小胞(EV)を自然放出する。小胞生体形成の分子機構、小胞の含有量、および病原体宿主界面におけるその機能に関する知識は非常に限られている。これらの質問に対処するには、EVの分離、精製、検証のための厳格な手順が必要です。以前は、結核が鉄制限にさらされたとき、小胞産生が増強され、宿主環境でMtbが遭遇した状態であることが判明した。ここでは、鉄欠乏性抗酸菌からEVを分離および精製するための完全で詳細なプロトコルです。定量的および定性的な方法が適用され、精製された EV が検証されます。
Introduction
マイコバクテリア細胞外小胞(MEV)は、膜結合ナノ粒子であり、60−300nmの大きさで、速く成長する抗酸菌1によって自然に放出される。病原性マイコバクテリアによって放出されるMEVは、免疫学的に活性なタンパク質、脂質、および糖脂質を介して宿主と相互作用するメカニズムを構成し、濃縮および保護された方法で分泌される2、3、4である。MEVを特徴付け、その生体発生と機能を理解するためには、小胞の浄化と検証の厳格かつ効率的な方法が不可欠です。これまで、MEVは鉄分が豊富な培地1、5、6、7、8で増殖したマイコバクテリアの培養濾液から単離されてきた。
しかし、以前の研究は、鉄の制限がMtbの小胞放出を大きく刺激することを実証し、おそらくMEV9で分泌されるシデラクチを介して鉄を捕捉する。高鉄培地で培養したMtbからMEVを分離する手順は説明されているが、低鉄培養物からMEVを得るための効率的な方法論は報告されていない。したがって、この方法の目的は、低鉄培養物から得られたMEVを単離、精製、定量し、生化学的および機能的アッセイやマイコバクテリアにおける小胞産生の遺伝的決定要因の分析に使用することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
真核細胞由来エキソソームを精製する複数の方法が開発された12.対照的に、細菌由来EV7を精製するための有効な方法に関する情報は限られています。Mtb由来のEVの効率的な分離は、この病原性マイコバクテリウムの成長における本質的な困難を考慮する必要があります。Mtbは長い分割時間(〜24時間)を有し、バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件で扱われるべ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ナノ粒子追跡分析を行うための抗MEV抗セラとナヴニート・ドグラを共有してくれたラファエル・プラドス=ロサレスに感謝しています。
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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