Summary
मस्तिष्क क्षेत्र की त्रि-आयामी संरचना के भीतर न्यूरोनल फाइबर की लंबाई विशिष्ट न्यूरोनल संरचनात्मक अखंडता या पतन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय पैरामीटर है। यह लेख एक उदाहरण के रूप में चूहों में मेनेर्ट के नाभिक बेसलिस के भीतर कोलिनेर्जिक फाइबर की लंबाई को मापने के लिए एक स्टीरियोलॉजिकल क्वांटिफिकेशन विधि का विवरण देता है।
Abstract
विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में कोलिनेर्गिक या अन्य न्यूरोनल एक्सोन की लंबाई अक्सर क्षेत्र के विशिष्ट कार्य से सहसंबद्ध होती है। स्टरोलॉजी विभिन्न मस्तिष्क संरचनाओं के न्यूरोनल प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। यहां हम बेसल फोरब्रेन के मेनर्ट (एनबीएम) के नाभिक बेसलिस में कोलिनेर्जिक फाइबर की कुल लंबाई का अनुमान लगाने के लिए सॉफ्टवेयर आधारित स्टेरोलॉजी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विधि लंबाई अनुमानों के लिए एक अंतरिक्ष गेंद की जांच का उपयोग करता है । कोलिनर्जिक फाइबर को कोलीन एसिटाइलट्रांसफराज (ChAT) इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा सहिजन पेरोक्सिडेस-डाइमिनोबेंजिडीन (एचआरपी-डीएबी) डिटेक्शन सिस्टम के साथ कल्पना की जाती है। स्टेनिंग प्रोटोकॉल स्टेरेलोजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में फाइबर और सेल संख्या अनुमान के लिए भी मान्य है। स्टरोलॉजी प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी रैखिक प्रोफाइल जैसे कोलिनोसेप्टिप्टिल फाइबर, डोपमिनर्गिक/कैटेकोलेमिनरफाइबर, सेरोटोनर्गिक फाइबर, एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं, या यहां तक कि वैस्कुलर प्रोफाइल के अनुमान के लिए किया जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्क में तंत्रिका फाइबर की लंबाई और/या घनत्व के मात्रात्मक अनुमान न्यूरोपैथोलॉजिकल अध्ययन के महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में कोलिनेर्गिक, डोपमिनेर्गिक और सेरोटोनर्गिक अक्षों की लंबाई अक्सर क्षेत्र के विशिष्ट कार्यों से सहसंबद्ध होती है। क्योंकि इन एक्सॉन का वितरण आम तौर पर विषम होता है, नमूना के दौरान पूर्वाग्रह से बचने के लिए डिजाइन आधारित स्टरोलॉजी का उपयोग किया जाता है। स्टरोलॉजी की अंतरिक्ष गेंद की जांच को ब्याज1के क्षेत्र में न्यूरोनल फाइबर जैसी लाइन जैसी संरचनाओं के कुशल और विश्वसनीय उपाय प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया है। जांच एक आभासी क्षेत्र है कि ऊतक में व्यवस्थित रूप से लगाया जाता है जांच की सतह के साथ लाइन चौराहों को मापने के लिए बनाता है । क्योंकि विश्लेषण के लिए ऊतक में क्षेत्र जांच करना असंभव है, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर एक आभासी त्रि-आयामी (3 डी) क्षेत्र प्रदान करता है, जो मूल रूप से विभिन्न व्यासों के गाढ़ा हलकों की एक श्रृंखला है जो क्षेत्र जांच की सतह का प्रतिनिधित्व करता है।
चयनात्मक कोलिनेर्गिक न्यूरोडिजनरेशन अल्जाइमर रोग (विज्ञापन)2,3,4की लगातार विशेषताओं में से एक है। बेकार कोलिनेर्गिक संचरण विज्ञापन में संज्ञानात्मक गिरावट के लिए एक कारक कारक माना जाता है। कोलिनेर्गिक रोग पार्किंसंस, लत और सिजोफ्रेनिया जैसे कई अन्य मानसिक विकारों में भी स्पष्ट है। कोलिनेर्गिक न्यूरोडिजेनरेशन के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन पशु मॉडल (उदाहरण के लिए, एसिटाइलकोलिन5,चैट प्रोटीन6,कोलिनेर्जिक फाइबर न्यूरोडिजेनरेशन में एमिलॉयड सजीले टुकड़े6के आसपास में कमी, और कोलिनेर्जिक फाइबर और सिनैप्टिक वैरिकोज7,8)में कमी की जाती है। माना जाता है कि फाइबर डिजनरेशन न्यूरोनल लॉस से पहले होता है, क्योंकि कोलिनेर्गिक न्यूरोनल लॉस हमेशा अध्ययन में नहीं देखा जाता है। कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स के अधिकांश बेसल अग्रमस्तिष्क और मस्तिष्क स्टेम में हैं, और उनके एक्सोन इस तरह के कॉर्टिस और हिप्पोकैम्पस के रूप में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए परियोजना। एनबीएम बेसल अग्रमस्तिष्क में स्थित है और विज्ञापन में आमतौर पर प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक पाया जाता है।
स्टरोलॉजी की आंशिक विधि कई स्तरों पर ऊतक के व्यवस्थित यादृच्छिक नमूने पर आधारित है। सेक्शन सैंपलिंग अंश (एसएसएफ) स्टेरेलोजी की आंशिक विधि के लिए अनुभागों का गैर-कंप्यूटर आधारित व्यवस्थित नमूना है। क्षेत्र नमूना अंश (एएसएफ) अनुभाग में रुचि के क्षेत्र के एक क्षेत्र का अंश है। मोटाई नमूना अंश (TSF) एक वर्ग की मोटाई का अंश है। अंतरिक्ष गेंद की जांच हमें आंशिक स्थानों पर 3 डी क्षेत्र में ब्याज की प्रोफाइल की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है। यहां हम प्रक्रियाओं को समझाने के लिए माउस मस्तिष्क के एनबीएम में कोलिनेर्गिक फाइबर की कुल लंबाई का आकलन करने के लिए एक अंतरिक्ष गेंद की जांच का उपयोग करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल ऊतक प्रसंस्करण, स्टेरेलोजी के लिए नमूना विधियों, ChAT एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला, और माउस मस्तिष्क के एनबीएम में कोलिनेर्जिक फाइबर लंबाई और फाइबर घनत्व का अनुमान लगाने के लिए निष्पक्ष स्टेरोलॉजी पर विवरण प्रदान करता है।
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Protocol
इन जानवरों का उपयोग करने के लिए सभी प्रक्रियाओं को कंसास सिटी दिग्गजों मामलों चिकित्सा केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । अठारह महीने पुराने चूहों स्वीडिश उत्परिवर्ती बीटा-एमिलॉयड अग्रदूत प्रोटीन (APPswe) और उनके C57/BL6 WT littermates प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया । प्रजनन और जीनोनोटपिंग का विवरण वह एट अल8में दिया गया है ।
1. परफ्यूजन और ऊतक प्रसंस्करण
- केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करचूहों को एनेस्थेटाइज करें। 9जारी रखने से पहले प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के लिए पिंच टोज़ ।
- बर्फ ठंड 0.1 M Dulbecco के फॉस्फेट बफरलव (DPBS) के ~50 mL के साथ ट्रांसकार्डिकुलली परफ्यूज 0.1 M फॉस्फेट बफर (पीबी)10में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के बाद।
सावधानी: पीएफए विषाक्त है। पीएफए के साथ काम करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें। - दिमाग10 निकालें और 0.1 एम पीबी में 4 डिग्री सेल्सियस में 4 डिग्री सेल्सियस में डीपीबीएस 3x के साथ पोस्टफिक्सेशन के लिए 4% पीएफए में विसर्जित करें।
- रातोंरात 0.1 डीपीबीएस में 15% सुक्रोज समाधान में बदलें और फिर 0.1 एम डीपीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 48 घंटे के लिए 30% सुक्रोज समाधान।
- सुक्रोज समाधान से ऊतक निकालें और एक क्रायोटोम कक्ष पूर्व सेट में -20 डिग्री सेल्सियस के तापमान के लिए फ्रीज। जमे हुए नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर सीलबंद ट्यूबों में सेक्शनिंग तक संग्रहित किया जा सकता है।
- इष्टतम काटने तापमान एम्बेडिंग माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) में ऊतकों को एम्बेड करें और एक नमूना डिस्क पर माउंट करें। क्रायोटोम का उपयोग करके कोरोनल विमान में धारावाहिक 30 माइक्रोन मोटी धाराओं में कटौती करें और क्रायोप्रोटेक्ंट समाधान (30% ग्लाइसेरोल, 30% एथिलीन ग्लाइकोल, 40% डीपीबीएस) से भरी 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में फलस्वरूप सभी वर्गों को इकट्ठा करें; चित्रा 1ए-सी)। एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
नोट: मोटा वर्ग (जैसे, 50 माइक्रोन) जब संभव हो बेहतर हैं। सुनिश्चित करें कि धाराओं को काटने के क्रम में रखा जाता है और सभी वर्ग पूरी तरह से क्रायोप्रोटेक्ंट में हैं। एक 96 अच्छी प्लेट वर्गों को इकट्ठा करने के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। - वाष्पीकरण और सुखाने से रोकने के लिए कुओं को प्लेट सीलर से ढक दें। आगे उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटस्टोर करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अनुभाग ChAT इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए कई महीनों के लिए स्थिर हैं।
2. आईएचसी के लिए व्यवस्थित अनुभाग चयन
नोट: त्रुटि (सीई) के स्वीकार्य गुणांक को प्राप्त करने के लिए आवश्यक वर्गों की कुल संख्या जानने के लिए एक प्रायोगिक अध्ययन किया जाना चाहिए। सीई मूल्य नमूना प्रक्रिया में त्रुटि की कुल राशि की अभिव्यक्ति है। सबसे कम मूल्य न्यूनतम त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है और 0.1 से कम सीई मूल्य यहां उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वीकार्य माना जाता है (सामग्री की तालिकादेखें)11।
- फ्रैंकलिन और पैक्सिनो सरूप जैसे मानक माउस मस्तिष्क एटलस के साथ रूपात्मक विशेषताओं की तुलना करके प्रत्येक मस्तिष्क के लिए पहले और अंतिम खंडों की पहचान करें। एनबीएम ब्रेगमा -0.0 मिमी से शुरू होता है और -1.6 मिमी पर समाप्त होता है। इसलिए करीब 50 सेक्शन में एनबीएम होता है। वर्गों की कुल संख्या स्टरोलॉजी के दौरान आवश्यक मापदंडों में से एक है। प्रत्येक8 खंड (एसएसएफ = 1/8) के चयन ने विश्लेषण के लिए कुल 6-7 अनुभाग दिए और हमारे प्रायोगिक अध्ययन में मात्रा अनुमान और फाइबर लंबाई अनुमान दोनों के लिए एक स्वीकार्य सीई प्राप्त किया।
- बेतरतीब ढंग से पहले आठ वर्गों में से एक के साथ शुरू और फिर प्रणालीगत रूप से एनबीएम युक्त पिछले पीछे अनुभाग तक हर 8खंड नमूना(चित्रा 1सी)।
3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
- क्रायोप्रोटेक्ट में कमरे के तापमान और फिर 0.1 M फॉस्फेट बफर (पीबी) को 6 अच्छी तरह प्लेटों में स्थानांतरित करें।
- पीबी में 3x धोएं।
- 15 मिन के लिए मेथनॉल में 0.3% एच2ओ2 में इनक्यूबेट।
- ट्रिस-बफरेड लवकुश (टीबीएस) में 3x धोएं।
- टीबीएस में 0.25% ट्राइटन एक्स-100 में 30 मिन के लिए इनक्यूबेट।
- 30 मिन के लिए टीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 में 10% सामान्य गोजातीय सीरम (एनबीएस) के साथ ब्लॉक करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 1% एनबीएस के साथ टीबीएस में बकरी विरोधी मानव ChAT प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) के 1:1,000 कमजोर पड़ने के साथ इनक्यूबेट।
- कमरे के तापमान पर टीबीएस में 3x धोएं। कमरे के तापमान पर आगे और सभी ऊष्मायन और धोने का प्रदर्शन करें।
- 1 घंटे के लिए बायोटिनेटेड गोजातीय विरोधी बकरी विरोधी माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इनक्यूबेट।
- टीबीएस में 3x धोएं।
- एविडिन-बायोटिन-पेरिक्सिडास कॉम्प्लेक्स (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इनक्यूबेट।
- टीबीएस में 3x धोएं।
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एक उन्नत डीएबी पेरोक्सिडेस सब्सट्रेट समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके विकसित करें।
सावधानी: DAB एक संदिग्ध कैंसरजन है। यह संपर्क और साँस लेना द्वारा विषाक्त है। डीएबी के साथ काम करते समय पीपीई का उपयोग करें। - खंड को आसुत पानी से दो बार धोएं और ट्रिस पीएच = 7.6 में रखें।
- जिलेटिनस्लाइड पर वर्गों माउंट। एक ऊतक से सभी वर्गों को एक ही स्लाइड पर रखा जा सकता है। हवा वर्गों को सुखाती है, 70%, 90%, 95%, और 100% इथेनॉल के साथ 5 मिन के लिए 2x निर्जलित करें, और फिर दो 10 मिन जाइलीन वॉश वाले वर्गों को साफ करें। बढ़ते माध्यम का उपयोग कर वर्गों को कवर स्लिप करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
नोट: निर्जलीकरण और समाशोधन का प्रसंस्करण समय वर्गों की मोटाई को प्रभावित करता है। इसलिए सभी वर्गों के लिए एक ही शर्तों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। वर्तमान अध्ययन में, अंतिम मोटाई के लिए औसत मूल्य 21.11 ± 0.45 माइक्रोन था। - धुएं के हुड में वर्गों को सूखने के लिए रखें। ड्राई सेक्शन स्टरोलॉजी के लिए तैयार हैं।
4. स्टेरेलोजी
नोट: इस्तेमाल किए गए माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें। न्यूमेरिकल अपर्चर (एनए) > 1.2 के साथ एक विसर्जन उद्देश्य उपयोगी होगा और यदि आवश्यक हो तो इसका उपयोग किया जाना चाहिए। स्लाइड जीनोटाइप या उपचार समूह के अनुसार समूहीकृत किया जाना चाहिए और कोडित। एक अध्ययन के लिए पूर्ण स्टरोलॉजी उसी व्यक्ति द्वारा की जानी चाहिए और स्टरोलॉजी करने वाले व्यक्ति कोव्यक्तिगतस्लाइड या समूह की जांच 1,12,13की पहचान के प्रति अंधा होना चाहिए ।
- सॉफ्टवेयर में एक नया अध्ययन खोलें। (फाइल एंड जीटी; न्यू स्टडी)। एक'स्टडी इनिशियलाइजेशन'डायलॉग बॉक्स खुलेगा। मल्टी-लेवल (अंश आधारित)(चित्रा 2ए)का उपयोग करके अध्ययन जानकारी भरें।
- पैरामीटर्सके तहत'वॉल्यूम'पर डबल क्लिक करें, जिससे वॉल्यूम डायलॉग बॉक्स खुलेगा। रुचि की विशेषता का नाम और'क्षेत्र बिंदु गिनतीजांच का चयन करें। आगेक्लिक करें ।
- अगले पैरामीटर पर डबल क्लिक करें,लेंथ।
- फीचर का नाम प्रदान करें (जैसे,'एल')सिलेक्ट'गोला'प्रोब और क्लिक करें नेक्स्ट।
- इसके बाद'स्टडी इनिशियलाइजेशन'डायलॉग बॉक्स पर क्लिक करें, जिससे'केस इनिशियलाइजेशन'बॉक्स खुलेगा। मामले की जानकारी भरें। अध्ययन शुरू करने से पहले समूहों को कोडित किया जाना चाहिए। वर्गों की कुल संख्या ब्याज के क्षेत्र वाले अंतिम खंड (चरण 2.1 देखें) के लिए ब्याज क्षेत्र वाले पहले खंड से शुरू होने वाले वर्गों की संख्या है। सेक्शन सैंपलिंग इंटरवल आठ है, क्योंकि आईएचसी धुंधला करने के लिए हर 8सेक्शन का चयन किया गया था।
- नेक्स्ट क्लिक करने से'प्रोब इनिशियलाइजेशन'डायलॉग बॉक्स खुलता है, जो अपने आप क्षेत्र चयन और वॉल्यूम अनुमान के लिए सबसे कम आवर्धन सेट कर देगा। सेटिंग्स की पुष्टि करें और जांचें कि चयनित कम आवर्धन पर ब्याज के क्षेत्र की पहचान की जा सकती है या नहीं। 'वॉल्यूम' पर डबल क्लिक करें और क्षेत्र की मात्रा अंश के लिए प्रति बिंदु 50,000 माइक्रोन3 भरें। क्लिक करें किया गया.
- ऑब्जेक्ट (उच्च) आवर्धन केतहत, 63x या 100x पर लंबाई निर्धारित करें। लंबाई-गोला संवाद बॉक्स खोलने के लिए'लेंथ'पर डबल क्लिक करें और गोला का व्यास 10 माइक्रोन सेट करें. क्लिक करें किया गया.
नोट: गार्ड जोन वर्गों की वास्तविक मोटाई के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए। ऑपरेटर को किसी भी नुकसान से बचने के लिए कई साइटों पर वर्गों की मोटाई की जांच करनी चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो अनुभाग मोटाई के आधार पर गार्ड क्षेत्र मोटाई को समायोजित करें। - फ्रेम क्षेत्र, फ्रेम ऊंचाई, गार्ड क्षेत्र, और फ्रेम रिक्ति के लिए उचित मूल्य निर्धारित करें।
नोट: ये मूल्य अध्ययन के क्षेत्र में ऑब्जेक्ट प्रोफाइल (फाइबर) की विषमता पर निर्भर करते हैं। 400 माइक्रोन2का एक फ्रेम क्षेत्र, 10 माइक्रोन की फ्रेम ऊंचाई, 2 माइक्रोन का गार्ड जोन, और 300 माइक्रोन का फ्रेम स्पेसिंग एनबीएम में फाइबर लंबाई अनुमान के लिए स्वीकार्य सीई मूल्य देता है। अगले मामले की ओर जाने से पहले इन मूल्यों के साथ एक प्रायोगिक अध्ययन किया जाना चाहिए । - प्रत्येक चरण के बाद सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करें। निर्देश या तो एक संवाद बॉक्स के रूप में दिखाई देते है और/या स्क्रीन के तल पर ।
- धारा 1 डालें।
- कम आवर्धन (5x) में, एनबीएम के चारों ओर मनमाने ढंग से सीमा बनाकर ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें। वीडियो विंडो के बाएं कोने पर अगला बटन क्लिक करें। निर्देशों का पालन करें और पुष्टि सभी हरे बिंदुओं एनबीएम में हैं। अंकों पर क्लिक करके अंक ों को शामिल या बाहर किया जा सकता है।
नोट: एनबीएम के आसपास कोई निश्चित, सेट सीमा नहीं है। चयन ज्यादातर अन्वेषक परिभाषित है । एनबीएम के चाट + कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स को इंटरनल कैप्सूल (आईसी) और ग्लोबस पैलिडस (जीपी) में देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, ChAT + कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स और उनके अनुमानों (फाइबर) और पूरे जीपी के साथ आईसी एनबीएम(चित्रा 1डी)में शामिल है। - निर्देशों का पालन करें और वर्तमान अंश पर फाइबर माप के लिए 63x में बदल जाते हैं। स्क्रीन पर'सेक्शन मोटाई'का डायलॉग दिखता है। अनुभाग की वास्तविक मोटाई को मापने के लिए अनुभाग की शीर्ष और निचली सतह सेट करें। मैनुअल जेड एक्सिस आंदोलन का उपयोग किया जाना चाहिए। पर क्लिक करें किया.
नोट: यदि क्षेत्र में कोई फाइबर नहीं है, तो कदम को अगले अंश स्थान पर जाने के लिए छोड़ दिया जा सकता है। - सेक्शन की फ्रेम ऊंचाई में जेड एक्सिस को धीरे-धीरे ऊपर से नीचे तक ले जाएं और वर्चुअल गोला जांच(चित्रा 3)की सतह पर सभी एक दूसरे के आकार के फाइबर को चिह्नित करें। जब किया जाता है, तो अगले स्थान पर जाने के लिए अगले क्लिक करें।
- सभी अंशों को पूरा करने के बाद, सॉफ्टवेयर अगले अनुभाग को डालने के लिए कहेगा। ऊतक के सभी छह या सात वर्गों के लिए चरण 4.9-4.12 दोहराएं।
- अंत में, सॉफ्टवेयर सीई मूल्यों(चित्रा 4)दिखा मामले के लिए एक परिणाम उत्पन्न करेगा। यदि सीई स्वीकार्य है, तो अगले मामले में आगे बढ़ें। फाइल एंड जीटी; नया मामला। यदि सीई स्वीकार्य नहीं है(चित्रा 4ए),सॉफ्टवेयर कुछ मापदंडों को बदलने के लिए सिफारिशें प्रदान करता है। कई मामलों में, फ्रेम स्पेसिंग को कम करने से सीई मूल्यों को स्वीकार्य सीमा(चित्र4बी)में कम कर दिया जाता है।
- सभी मामलों को पूरा करने के बाद, प्रत्येक मामले और समूह(फ़ाइल और जीटी; परिणाम)के लिए परिणाम उत्पन्न करें।
5. विश्लेषण और आंकड़े
- सॉफ्टवेयर प्रत्येक नमूने और प्रत्येक समूह के लिए डेटा प्रदान करता है। सॉफ्टवेयर स्वयं एसएसएफ, एएसएफ और टीएसएफ जैसे अंशों की गणना करता है, और संदर्भ क्षेत्र (इस मामले में, एनबीएम)(चित्रा 4बी)में फाइबर की कुल संदर्भ मात्रा (वीआरईएफ)और कुल लंबाई (एल) प्रदान करता है। डेटा निर्यात और समूह विश्लेषण के बीच के लिए पसंद के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर को बचाने या कॉपी। तालिका 1 सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए विशिष्ट परिणाम डेटा दिखाती है। संदर्भ मात्रा के साथ कुल फाइबर लंबाई को विभाजित करके फाइबर घनत्व (एलवी) का विश्लेषण करें।
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Representative Results
प्रतिनिधि परिणाम तालिका 1 और चित्रा 5 में दिखाए जातेहैं । ग्रुप सी, जिसे एपीपीएसवे समूह (एपीपीडब्ल्यू) के रूप में डिकोड किया गया था, में उनके जंगली प्रकार (जंगली) लिटरमेट्स की तुलना में फाइबर लंबाई(चित्रा 5बी)और फाइबर लंबाई घनत्व(चित्रा 5सी)काफी कम थी। परिणामों से पता चला है कि दोनों समूहों के बीच एनबीएम की मात्रा में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था(चित्र5ए)।
चित्रा 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ऊतक प्रसंस्करण और नमूना का चित्रण। नमूना तैयार करना और नमूना। (क)नमूना डिस्क पर बढ़ते से पहले सेरिबैलम और घ्राण बल्ब को हटा दिया जाता है। (ख)सेक्शन कटिंग के लिए नमूना डिस्क पर मस्तिष्क का अभिविन्यास। एक गोलार्द्ध पर एक उथला देशीयमुख चीरा (एक रेखा के साथ चिह्नित) वर्गों में मस्तिष्क के पक्ष की पहचान करने में मदद करता है। (ग)24 अच्छी प्लेट का योजनाबद्ध आरेख 24 अच्छी प्लेट (एक्स' के रूप में चिह्नित) से हर 8खंड के व्यवस्थित चयन को दिखाता है। (D)योजनाबद्ध तरीके से चयनित छह खंडों में एनबीएम की सीमाओं का परिसीमन करने वाले कोरोनल वर्गों के योजनाबद्ध आरेख । (ई-जी) कोरोनल वर्गों की प्रतिनिधि छवियां ChAT और NBM के स्थान के लिए इम्यूनोदाग (उल्लिखित) । (एच)एनबीएम की सीमाओं को दिखाने वाली एक उच्च आवर्धन छवि । एलवी = पार्श्व वेंट्रिकल; वीएल = वेंट्रोलेटरल थैलेमिक नाभिक; आईसी = आंतरिक कैप्सूल; जीपी = ग्लोबस पैलिडस; सीपीयू = कॉडेट पुटामेन (स्ट्रेटम); एमबीएम = मेनेर्ट के नाभिक बेसलिस (फ्रैंकलिन और पैक्सिनोस माउस एटलस में 'बी' के रूप में प्रतिनिधित्व किया गया)। स्केल बार = 1 मिमी (ई-जी),200 माइक्रोन(एच)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: स्क्रीनशॉट छवियां। }'स्टडी इनिशियलाइजेशन'(बी)'केस इनिशियलाइजेशन',और(C)'प्रोब इनिशियलाइजेशन'डायलॉग बॉक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एक ऑप्टिकल विक्षेत्र का उपयोग कर क्षेत्र जांच । प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट छवियां एक क्षेत्र के चार विमानों और फाइबर को काटने के अंकन को दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम। (ए)एक अस्वीकार्य सीई दिखाता है और(बी)लंबाई के आकलन के लिए एक स्वीकार्य सीई दिखाता है । प्रत्येक मामले के लिए एएसएफ, एसएसएफ और टीएसएफ भी परिणामों में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: प्रतिनिधि डेटा और विश्लेषण। दो समूहों के एनबीएम में वॉल्यूम(ए),लेंथ(बी),और लेंथ डेंसिटी(सी)का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। छात्र टी-टेस्ट का उपयोग करके दो अलग-अलग समूहों के भीतर डेटा का विश्लेषण किया गया था। *पी एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| समूह | मामला # | मात्रा (μm^3) | लंबाई (μm) | एलवी (μm/μm^3) |
| बी | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| बी | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| बी | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| सी | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| सी | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| सी | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| आँकड़े | ||||
| मतलब ग्रुप बी | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| एसडी ग्रुप बी | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| मतलब ग्रुप सी | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| एसडी ग्रुप सी | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B बनाम C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
तालिका 1: प्रतिनिधि डेटा और विश्लेषण। मात्रा और लंबाई मूल्यों को सीधे स्टरोलॉजी सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए परिणामों से कॉपी किया गया था। प्रत्येक मामले के मात्रा मूल्यों द्वारा लंबाई मूल्यों को विभाजित करके लंबाई घनत्व (एलवी) की गणना की गई थी। पी मानों की गणना छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी।
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Discussion
यहां हम एक अंतरिक्ष गेंद (गोला) जांच का उपयोग कर एनबीएम में कोलिनेर्जिक फाइबर के घनत्व का अनुमान लगाने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं। यह जांच ब्याज के क्षेत्र में कुल फाइबर लंबाई का अनुमान है । फाइबर घनत्व प्राप्त करने के लिए कुल लंबाई को क्षेत्र की मात्रा से विभाजित किया जा सकता है। क्षेत्र की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए, कैवेलियरी पॉइंट काउंट विधि का उपयोग किया गया था। कैवेलियरी पॉइंट काउंट विधि किसी भी क्षेत्र के लिए 3 डी संदर्भ मात्रा का एक निष्पक्ष और कुशल अनुमानहै। विधि अंक (क्षेत्र अंशों का प्रतिनिधित्व) की गिनती करके एक खंड की कट सतह पर क्षेत्र के अनुमान की गणना करती है और फिर11का विश्लेषण किए गए दो वर्गों के बीच की दूरी से गुणा करती है। विधि श्रम गहन, ब्याज के क्षेत्र की परिधि के सटीक ट्रेसिंग की आवश्यकता नहीं है । इसका उपयोग कोशिकाओं और फाइबर के घनत्व का अनुमान लगाने के लिए ऑप्टिकल आंशिक रूप से किया जाता है।
स्टीरियोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक सटीक नमूना विधि की आवश्यकता होती है। ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र को धुंधला के साथ ठीक से परिभाषित किया जाना चाहिए। एनबीएम एपी ब्रेग्मा -0.0 मिमी से -1.6 मिमी प्रति फ्रैंकलिन और पैक्सिनोस माउस एटलस के बीच बैठता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, वर्गों को व्यवस्थित रूप से, बेतरतीब ढंग से चुना जाना चाहिए, जिसका अर्थ है कि पहले खंड का चयन बेतरतीब ढंग से किया जाना चाहिए और फिर अन्य वर्गों को व्यवस्थित रूप से चुना जाना चाहिए। एक वयस्क माउस मस्तिष्क के लिए, एनबीएम में लगभग 1,600 माइक्रोन (पूर्वकाल-पीछे) होते हैं, जिसका अर्थ है लगभग 53 कोरोनल वर्ग 30 माइक्रोन मोटी। इसके बाद, यदि प्रत्येक8 खंड का चयन किया जाता है, तो स्टीरियोलॉजिकल विश्लेषण के लिए दाग के लिए 6−7 अनुभाग आवश्यक होंगे। हमारी सामान्य प्रक्रिया में, एनबीएम में कोलिनेर्जिक फाइबर की कुल संख्या का आकलन करने के लिए 6−7 अनुभाग पर्याप्त हैं। पद्धतित्मक अनुकूलन12की शुरुआत में सत्यापन के लिए सीई का विश्लेषण सुझाया गया है ।
एक उचित धुंधला पद्धति एक अध्ययन के लिए बुनियादी आवश्यकता है । कोलिनेर्जिक फाइबर के लिए चैट धुंधला होना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और कई एंटीबॉडी कुछ सेलुलर हिस्सों को दाग देते हैं लेकिन दूर की एक्सोडेनड्रिटिक प्रक्रियाएं नहीं। कृपया ChAT धुंधला8के बारे में प्रासंगिक विवरण के लिए हमारे पहले वर्णित प्रोटोकॉल का उल्लेख करें ।
विधि अनिवार्य रूप से मोटी वर्गों की आवश्यकता होती है क्योंकि हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण ऊतक में सिकुड़न का कारण बनता है। आदर्श रूप से, अंतरिक्ष गेंद की जांच के लिए 20 माइक्रोन पोस्ट-प्रोसेसिंग, अंतिम मोटाई (अक्सर प्रारंभिक ऊतक अनुभाग मोटाई की तुलना में पतले) से अधिक के वर्गों की आवश्यकता होती है। इसलिए, 50 माइक्रोन की एक धारा मोटाई की सिफारिश की जाती है। सिकुड़न आम तौर पर असमान है, और यह ऊतक के भीतर मात्रा में विकृतियों को प्रभावित कर सकता है और इसलिए एलवी मूल्य में बदल जाता है। उदाहरण के लिए, केशिका लंबाई घनत्व में एक बहुगुना अंतर देखा गया था जब इसका विश्लेषण वीवो में मल्टीफोर्न इमेजिंग14,15का उपयोग करके किया गया था। इस मुद्दे को ध्यान में रखते हुए, प्रति मात्रा लंबाई के बजाय प्रति क्षेत्र लंबाई की रिपोर्ट करना अधिक प्रभावी है।
हालांकि प्रोटोकॉल में दिए गए मूल्यों ने पूरी तरह से काम किया, लेकिन एक व्यक्तिगत अध्ययन के लिए एक प्रायोगिक अध्ययन हमेशा सलाह दी जाती है। एक ऊतक नमूना मामले को पूरा करने के बाद, सॉफ्टवेयर चुने हुए नमूना डिजाइन के लिए एक सीई मूल्य प्रदान करता है। सीई मूल्य का उपयोग अनुमान की सटीकता का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है और इसकी गणना कई सूत्रों द्वारा की जा सकती है। यहां उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर सीई का विश्लेषण करने के लिए गंडरसन के 1 99 9 के सूत्र का उपयोग करता है और यदि मूल्य 0.11,16से कम हैं तो इसे स्वीकार्य मानते हैं। नमूना डिजाइन योजना को तब तक समायोजित किया जाना चाहिए जब तक कि प्रोटोकॉल को अन्य नमूनों के लिए अनुकूलित करने से पहले सीई मूल्य स्वीकार्य न हो जाए। सामान्य तौर पर, नमूना की बढ़ी हुई संख्या (फ्रेम अंतराल को कम करके) सीई मूल्य को कम कर देती है। व्यावहारिक रूप से जैविक प्रणाली में कोई संरचना एक आदर्श लाइन प्रोफ़ाइल नहीं है, लेकिन रिबन या सिलेंडर। इसलिए, फोकसिंग पॉइंट पर सटीक इंटरसेप्टिंग सुविधा तय करना व्यक्ति से दूसरे व्यक्ति में भिन्न होता है। इस प्रकार, एक विशेष अध्ययन के सभी नमूनों की नसबंदी एक ही व्यक्ति द्वारा किया जाना चाहिए। संभावित पूर्वाग्रह से बचने के लिए, स्टेरेलोजी ऑपरेटर नमूना पहचानकर्ता के लिए अंधा होना चाहिए।
इस विधि में प्रजनन क्षमता एक बड़ी चिंता का विषय है । इसका एक कारक नमूना प्रसंस्करण के दौरान ऊतक सिकुड़न और विकृति है जिसे वीवो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी13,14,15में उपयोग करके कुछ हद तक दूर किया जा सकता है । अंतरिक्ष गेंद संरचनाओं की कल्पना करने के लिए उच्च विपरीत धुंधला और अच्छा इमेजिंग संकल्प की आवश्यकता है। चूंकि फाइबर आमतौर पर रैखिक रूप में नहीं होते हैं, इसलिए इंटरसेप्टका निर्धारण ज्यादातर ऑपरेटर का निर्णय रहता है। इस समस्या को दूर करने के लिए हिस्टोलॉजिकल फीचर्स के ऑटोमेटेड सेगमेंटेशन का प्रस्ताव किया गया है। हालांकि, यह अभी तक13उपलब्ध नहीं है ।
स्टरोलॉजी का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह 3 डी ऊतक में संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए एक निष्पक्ष योजना प्रदान करता है। अंतरिक्ष गेंद की जांच ऊतक नमूनों के भीतर आइसोट्रोपिक अंश प्रदान करता है और इसलिए फाइबर लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है । फाइबर घनत्व का विश्लेषण करने के लिए एक वैकल्पिक विधि हिस्टोकेमिकल धुंधला के ऑप्टिकल घनत्व को मापरही है। धुंधला तीव्रता आधारित तरीके धुंधला घनत्व का अर्धमात्रात्मक अनुमान प्रदान करते हैं और एनबीएम में कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स और फाइबर के परिवर्तनों को अलग करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील हो सकते हैं या नहीं हो सकते हैं। अंतरिक्ष गेंद (गोला) जांच का उपयोग करने वाले स्टीरियोलॉजिकल तरीके अपने दृश्य विशेषताओं के आधार पर फाइबर के निर्धारण का उपयोग करते हैं और फाइबर की वास्तविक लंबाई का अनुमान प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल का उपयोग मस्तिष्क में अन्य रैखिक प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे चोलिनोसेप्टिव फाइबर (एसिटाइल कोलीन एस्टरेस हिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करना), डोपमिनेर्गिक या कैटेकोलेमिनरफाइबर (टायरोसिन हाइड्रोक्सीलेस इम्यूनोस्टेनिंग), सेरोटोनर्गिक फाइबर (सेरोटोनिन इम्यूनोस्टेनिंग), वैस्कुलर संरचनाएं (सीडी31 इम्यूनोस्टेनिंग), या एस्ट्रोसाइटप्रोसेस (ग्लिल फिब्रिलेएसिडिक जीएफएपी, इम्यूनोस्टेनिंग)17,18,19,20,21 .
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को चिकित्सा अनुसंधान और विकास सेवा, दिग्गजों मामलों के विभाग (योग्यता की समीक्षा 1I01BX001067-01A2), अल्जाइमर एसोसिएशन (NPSPAD-11-202149), और मिडवेस्ट बायोमेडिकल से संसाधनों से W.Z.S. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था रिसर्च फाउंडेशन।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. Unbiased Stereology-A Concise Guide. , Johns Hopkins University Press. (2011).
- West, M. J.
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
