Summary
El protocolo presentado utiliza citometría de flujo para cuantificar el número de células muertas y proliferantes en enteroides de ratón cultivados. Este método es útil para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación y supervivencia de los organoides.
Abstract
El epitelio intestinal actúa como una barrera que impide que el contenido luminal, como la microbiota patógena y las toxinas, entre en el resto del cuerpo. La función de barrera epitelial requiere la integridad de las células epiteliales intestinales. Mientras que la proliferación de células epiteliales mantiene una capa continua de células que forma una barrera, daño epitelial conduce a la disfunción de barrera. Como resultado, el contenido luminal puede atravesar la barrera intestinal a través de una vía sin restricciones. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con muchas enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal. Las criptas intestinales aisladas del ratón se pueden cultivar y mantener como estructuras similares a la cripta, que se denominan organoides intestinales o "enteroides". Los enteroides son ideales para estudiar la proliferación y muerte celular de las células epiteliales intestinales in vitro. En este protocolo, describimos un método simple para cuantificar el número de células proliferativas y muertas en enteroides cultivados. 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU) y yoduro de propidium se utilizan para etiquetar células proliferantes y muertas en enteroides, y la proporción de células muertas y proliferantes se analizan por citometría de flujo. Esta es una herramienta útil para probar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación de células epiteliales intestinales y la supervivencia celular.
Introduction
Una función fundamental de las células epiteliales intestinales es proteger la entrada de contenidos luminales como bacterias patógenas y toxinas1,2. Para realizar tal función, las células madre intestinales proliferan y diferencian continuamente en una variedad de células epiteliales, incluyendo enterocitos y células secretoras, que forman una barrera mediante la formación de conexiones estrechas3. La rápida renovación de las células epiteliales intestinales requiere una estricta coordinación de la proliferación celular, la diferenciación celular y la muerte celular4,5. La reducción de la proliferación celular o la muerte celular excesiva conduce a daño epitelial y función de barrera comprometida1,6. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con enfermedades inflamatorias intestinales7,8.
Un método para cultivar criptas intestinales ha sido desarrollado previamente. Usando esta técnica, las criptas de ratón aisladas crecen en organoides intestinales (enteroides), que tienen estructuras similares a criptas y contienen todo el linaje celular epitelial intestinal9,10. 5-Etil-2'-desoxiuridina (EdU) es un análogo de timidina que es capaz de reemplazar la timina (T) en el ADN que se está replicando durante la proliferación celular. Las células proliferativas pueden ser etiquetadas rápida y precisamente por la tinción edU. El yoduro de propiduro (PI) es un análogo del bromuro de etidio que libera fluorescencia roja al insertarse en ADN de doble cadena. PI detecta específicamente las células muertas, ya que sólo pasa a través de la membrana celular dañada.
En este protocolo, primero describimos cómo aislar las criptas del intestino delgado murino y luego cultivarlas como enteroides in vitro. A continuación, describimos cómo analizar las células proliferativas y muertas en los enteroides por la incorporación de EdU y PI y la citometría de flujo.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Recursos Genómicos de Cambridge-Suda (CAM-SU) de la Universidad de Soochow.
1. Aislamiento y cultivo organoides intestinales
- Aislamiento de criptas intestinales y cultura enteroide
- Eutanasia un ratón de tipo salvaje de 8 semanas de edad con inhalación deCO2. Use fórceps tisulares y tijeras de iris finas para diseccionar aproximadamente 8 cm de íleon.
- Enjuague con una jeringa con aguja de alimentación de gavage con aproximadamente 40 ml de salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco en frío, luego corte longitudinalmente con tijeras y abra el íleon.
- Cortar el íleon en trozos pequeños (0,5 x 1,0 cm). Coloque las piezas en 5 ml de DPBS estéril en frío hielo en un tubo cónico de 15 ml, luego roca durante 5 minutos sobre hielo.
- Utilice un controlador de pipeta para aspirar el DPBS y reemplazarlo por 10 ml de búfer frío 1 (2 mM EDTA en DPBS). Roca durante 30 minutos sobre hielo.
- Utilice el controlador de pipeta para aspirar el búfer 1 y reemplazarlo por 10 ml de tampón frío 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de sacarosa en DPBS). Agitar durante 2 x 3 minutos a mano (80 sacudidas/min).
- Tome una gota de 20 l de contenido de tampón 2 después de agitar e inspeccionar bajo un microscopio.
- Filtrar el contenido del búfer 2 con un colador de celda estéril de 70 m, luego recoger el tampón filtrado con un tubo cónico de 50 ml.
- Pipetear 20 l de filtrado en la diapositiva para contar las criptas. Transfiera un volumen suficiente del buffer 2 del paso 1.1.7 para asegurarse de que hay 500 criptas/pozo.
- Girar hacia abajo a 150 x g durante 10 min a 4 oC. Una vez que el hilado está terminado, aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
- Suspenda las criptas en 50 l de matriz de membrana del sótano (por ejemplo, Matrigel) por 500 criptas, pipeta hacia arriba y hacia abajo (teniendo cuidado de evitar burbujas), luego coloque una gota de 50 l de matriz de membrana del sótano / mezcla de cripta en el centro de un pozo en una placa de 24 pozos. Incubar durante 30 min a 37oC para polimerizar la matriz de membrana del sótano.
- Después de 30 min de polimerización, agregue cuidadosamente 600 l de medios minigut (medio eagle modificado avanzado de Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanina-L-glutamina, pluma/estreptococo [100 unidades/ml], 10 mM hepes, Suplemento N2 [1:100], suplemento B27 [1:50] con factor de crecimiento epidérmico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], y Y27632 [10 m]) a cada pocil, luego devuelva la placa a la incubadora de 37 oC. Observe bajo un microscopio cada día y cambie el medio cada 2 a 3 días.
- Passaging enteroide
NOTA: Para cultivos largos, los enteroides deben dividirse aproximadamente cada semana.- Para pasar los enteroides, coloque la placa de cultivo de tejido según el hielo. Aspirar los medios y añadir 1 mL de DPBS frío a cada poca. Utilice una punta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano.
- Pasar hacia arriba y hacia abajo una vez a través de una jeringa de insulina de 1 ml (27 G) y en un tubo cónico de 15 ml. Girar hacia abajo durante 5 min a 150 x g a 4 oC.
- Utilice la pipeta para eliminar DPBS. Resuspender en 50 l de matriz de membrana de sótano/pozo.
- Colocar la placa en una incubadora de 37oC durante 30 minutos para permitir que la matriz de membrana del sótano se polimerice. Superponga cada pozo con 600 l de medios ENR (medios minigut, EGF de 50 ng/ml, Noggin de 100 ng/ml, 500 ng/ml de R-espondina), luego devuelva la placa a la incubadora.
2. Análisis de citometría de flujo de células positivas edU en enteroides
NOTA: La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para el análisis de citometría de flujo de celdas positivas de EdU en enteroides.
- Incubación de enteroides con EdU
- Cultivar enteroides desde el paso 1.2.4 durante 5-7 días. Pasaje enteroides en una nueva placa de 24 pozos en una relación de división de 1:2. Añadir 600 sl de medio ENR a cada poca. Incubar enteroides durante 4 o 5 días en una incubadora de 37oC.
- Establezca el grupo de control (enteroides no tratados) y el grupo experimental (enteroides tratados con interleucina de 5 ng/ml 22 [IL-22]). Prepare al menos tres réplicas para cada grupo.
- Añadir EdU al medio ENR para preparar el medio de EdU con una concentración de 50 m. Añadir 600 ml de medio de EdU a cada poca y incubar durante 2 h en una incubadora de 37oC. Establezca un pozo de enteroides sin tratamiento EdU como un control negativo para la resta de fondo.
- Cosecha de enteroides de la matriz de membrana del sótano
- Utilice un controlador de pipeta para aspirar el medio EdU y lavar 1x con DPBS. Añadir 1 mL de DPBS.
- Utilice la punta de la pipeta P1000 y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano. Pasar a un tubo de 15 ml y girar hacia abajo a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Añadir 500 l de enzimas de disociación celular(Tabla de materiales)e incubar durante 15 min a 37 oC. Utilice la punta de la pipeta P200 y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para descomponer los enteroides en células individuales.
- Añadir 3 ml de medio DMEM que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) y pipetear repetidamente con una punta de pipeta P1000.
- Gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min y aspire el medio sobrenadante. Resuspenda las celdas con 1 ml de DPBS.
- Fijación y permeabilización de células
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml, gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante.
- Resuspenda las células con 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA), fije durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min.
- Resuspender células con 1 ml de tensioactivo no iónico al 0,5%. Incubar durante 10 min a RT.
- Gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Lavar 1x con DPBS y girar hacia abajo para eliminar el sobrenadante.
- Detección de EdU
- Prepare las soluciones de stock para cada componente de antemano: 1) solución de trabajo de la solución de trabajo Alexa Fluor azide, 2) de 1 búfer de reacción EdU y 3) solución de stock 10x de aditivo de búfer EdU.
- Prepare 1 aditivo tampón EdU diluyendo la solución 10x 1:10 en agua desionizada. Prepare esta solución fresca.
- Preparar el cóctel de reacción de acuerdo con la Tabla 1.
NOTA: Agregue los ingredientes en el orden indicado en la tabla. Utilice el cóctel de reacción dentro de los 15 minutos de la preparación. - Añadir 100 l de cócteles de reacción a cada tubo de 1,5 ml. Resuspender las células, proteger de la luz, incubar durante 30 minutos a RT.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min y aspirar suavemente la solución de reacción con la punta de la pipeta.
- Añadir un tensioactivo no iónico penetrante a cada tubo para lavar 1x en RT. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirar el sobrenadante con punta de pipeta suavemente, y resuspender las células en 1 ml de DPBS.
- Análisis de células por citometría de flujo
- Filtre las celdas resuspendidas con un colador de 40 m y, a continuación, recoja las celdas filtradas con un tubo cónico de 15 ml. Realice la detección en la máquina FACS tan pronto como sea posible.
NOTA: Si las condiciones son limitadas, las muestras manchadas de celda deben almacenarse en la oscuridad a 4 oC y probarse en un plazo de 3 días. - Seleccione el canal apropiado (según el tipo de azida de Alexa Fluor en el kit EdU; aquí, canal rojo) y voltaje (aquí, 150–350 V) para el análisis de citometría de flujo.
- Estrategia de Gating
- Dibuje una gráfica de pseudocolor FSC-A (eje x) frente a SSC-A (eje y) y distribuya la mayoría de las celdas al rango visible del mapa de puntos ajustando el voltaje. Seleccione la población celular (R1) y excluya los residuos celulares en la esquina inferior izquierda.
- A partir de la población celular R1, establezca un FSC-A (eje x) vs. Gráfica de pseudocolor FSC-H (eje y) y establezca la puerta para seleccionar celdas individuales (R2) para excluir los grumos de celda.
- A partir de la población celular R2, establecer la intensidad de fluorescencia (eje x) vs. número de celda (eje Y) y utilice el control negativo para establecer la puerta. La región de la señal fluorescente es una región celular positiva (R3). Compare la relación de células positivas de EdU (R3) entre los grupos experimentales y de control.
- Filtre las celdas resuspendidas con un colador de 40 m y, a continuación, recoja las celdas filtradas con un tubo cónico de 15 ml. Realice la detección en la máquina FACS tan pronto como sea posible.
3. Análisis de citometría de flujo de células PI-positivas en enteroides
NOTA: La Figura 2 muestra el flujo de trabajo para el análisis de citometría de flujo de celdas PI positivas en enteroides.
- Incubación de células enteroides con PI
- Cultivar enteroides desde el paso 1.2.4 durante 5-7 días. Pasaje enteroides en una nueva placa de 24 pozos en una relación de división de 1:2. Añadir 600 sl de medio ENR a cada poca. Incubar enteroides durante 4 o 5 días en una incubadora de 37oC.
- Establezca el grupo de control (sin tratar) y el grupo experimental (tratado con IL-22), utilizando al menos tres réplicas para cada grupo.
- Añadir PI al medio ENR para preparar el medio PI con una concentración de 3 m.
- Añadir 600 éL de pi médium a cada poca y incubar durante 30 min en una incubadora de 37oC. Establezca un pozo de enteroides sin tratamiento PI como un control negativo para la resta de fondo.
- Cosecha enteroides de la matriz de membranadel sótano siguiendo los pasos 2.2.1-2.2.5.
- Análisis de células por citometría de flujo
- Filtrar las células resuspendidas con un colador de 40 m y recoger las células filtradas con un tubo cónico de 15 ml.
- Realice la detección en la máquina FACS tan pronto como sea posible.
NOTA: Si las condiciones son limitadas, las muestras manchadas de celda deben almacenarse en la oscuridad a 4 oC y probarse en un plazo de 3 días. - Seleccione el canal apropiado (aquí, canal rojo) y el voltaje (aquí, 150–350 V) para el análisis de citometría de flujo.
- Utilice la misma estrategia de gating que se describe en la sección 2.5.3.
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Representative Results
Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano. Enteroids comenzó a formar brotes 2 días después del aislamiento. En el día 6, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos desechos (células muertas) en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser repasados en esta etapa(Figura 3).
Numerosos estudios han demostrado que las citoquinas inflamatorias son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis epitelial intestinal. La expresión anormal de las citoquinas inflamatorias está estrechamente asociada con la aparición de enfermedades inflamatorias intestinales11. Por ejemplo, nuestro estudio anterior mostró que IL-22 promueve la proliferación de células amplificadoras de tránsito, pero también agota Lgr5+ células madre12.
Los enteroides fueron tratados con IL-22 durante 3 días, después de lo cual el ADN sintético fue etiquetado con EdU para indicar la proliferación celular. Los enteroides tratados con IL-22 mostraron un mayor número de células EdU+ (Figura 4A). IL-22 aumentó las células proliferantes de 40,1% a 83,5% según lo analizado por la citometría de flujo(Figura 4B). El tratamiento con IL-22 también aumentó la muerte celular en enteroides, indicada por la tinción de PI(Figura 5A). IL-22 aumentó las células muertas de 4,9% a 16,2% según lo analizado por la citometría de flujo(Figura 5B).
Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo para el análisis de citometría de flujo de celdas positivas en EdU en enteroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de trabajo para el análisis de citometría de flujo de celdas PI positivas en enteroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de Brightfield de enteroides a 2, 4 y 6 días de aislamiento posterior a la cripta. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: IL-22 aumenta la proliferación de enteroides. (A) Los enteroides se cultivaron en medio sin o con IL-22 (5 ng/ml) durante 3 días e incubados con EdU (rojo) durante 1 h. Barra de escala de 100 m. (B) Datos de citometría de flujo de enteroides cultivados sin (izquierda) o con (derecha) IL-22. Los datos son representativos de tres experimentos separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: IL-22 promueve la muerte celular en enteroides. (A) Los enteroides se cultivaron en medio sin o con IL-22 (5 ng/mL) durante 3 días y se teñiron con yoduro propidium (rojo). Barra de escala a 100 m. (B) Datos de citometría de flujo de enteroides cultivados sin (izquierda) o con (derecha) IL-22. Los datos son representativos de tres experimentos separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componentes de reacción | Número de pozos de placas de 24 pocillos | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x Búfer de reacción | 86 l | 172 l | 430 l | 860 l | 1.72 L | 4.3 L |
| CuSO4 | 4 l | 8 l | 20 l | 40 l | 80 l | 200 l |
| Alexa Fluor azide | 0,25 sL | 0,5 l | 1.25 l | 2,5 l | 5 l | 12,5 l |
| Aditivo amortiguador de reacción | 10 l | 20 l | 50 l | 100 l | 200 l | 500 l |
| Volumen total | 100 l | 200 l | 500 l | 1 L | 2 l | 5 l |
| NOTA: Agregue los ingredientes en el orden indicado en la tabla. | ||||||
Tabla 1: Cóctel de reacción EdU.
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Discussion
Este protocolo detalla los pasos necesarios para el cultivo de enteroides in vitro y la cuantificación de células EdU y PI-positivas en los enteroides por citometría de flujo. Hay varias ventajas de esta estrategia. En primer lugar, el etiquetado EdU se utiliza para detectar células que proliferan en enteroides. En comparación con el ensayo tradicional de BrdU, el método de etiquetado EdU es más rápido, más sensible y más preciso. EdU es muy similar a la timina (T), que reemplaza la timina en la síntesis de ADN durante la división celular. En comparación con el anticuerpo BrdU, la EdU es más fácil de difuminar en la célula, y la detección de EdU no requiere desnaturalización del ADN ni una reacción de antígeno-anticuerpo. En segundo lugar, el análisis de citometría de flujo puede cuantificar de forma rápida y precisa las células proliferantes (EdU+) y muertas (PI+) en enteroides.
Para realizar con éxito todo el procedimiento, hay aspectos críticos a tener en cuenta. En primer lugar, es importante cultivar enteroides en condiciones suficientes. Los enteroides bien crecidos deben tener un montón de cogollos, que contienen células proliferativas. En segundo lugar, es importante dividir los enteroides de manera oportuna. Los desechos acumulados en el lumen contienen células muertas, que se pueden manchar con PI. Esto es perjudicial para el siguiente análisis de citometría de flujo. En tercer lugar, debido a los múltiples pasos (es decir, tinción celular, fijación celular, ruptura de membrana y centrifugación), las células se pueden perder fácilmente durante el procedimiento. Por lo tanto, es importante recopilar un número suficiente de enteroides. Es importante combinar 2 x 3 pocillos (en una placa de 24 pocillos) de enteroides antes de la fijación. Por último, es fundamental añadir ingredientes al tampón para detectar EdU, de lo contrario la reacción no procederá de manera óptima.
En resumen, el protocolo detalla los pasos para la realización de enteroides de ratón in vitro y la cuantificación de células muertas y proliferantes por citometría de flujo. Los enteroides son herramientas útiles para el modelado de enfermedades y el descubrimiento terapéutico de fármacos. Este protocolo ayuda a explorar los efectos de las citoquinas inflamatorias, patógenos y fármacos en la proliferación celular y la supervivencia celular en modelos de cultivo enteroide.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971062, 31900326 y 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Universidad de Nanjing (KF-GN-202004). La Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior Jiangsu de China (19KJB320003), el Programa de Vida y Tecnología de la Ciudad de Suzhou (SYS2019030), y el Programa de Innovación en Investigación para Graduados Universitarios de la Provincia de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabajo también cuenta con el apoyo de Tang Scholar de la Universidad de Soochow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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