JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60503
, , , ,
1Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Этот протокол описывает микрорассечение лазерного захвата для изоляции хряща и кости от свежезамороженных секций эмбриона мыши. Хрящ и кости могут быть быстро визуализированы кресилфиолетовым окрашиванием и собраны именно для получения высококачественной РНК для транскриптомического анализа.

Abstract

Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции конкретных типов клеток или областей, представляющих интерес от неоднородных тканей. Клеточная и молекулярная сложность скелетных элементов возрастает с развитием. Неоднородность тканей, например, на стыке хрящевых и косых элементов друг с другом или с окружающими тканями, является одним из препятствий для изучения развития хряща и костей. Наш протокол обеспечивает быстрый метод обработки тканей и изоляции хряща и кости, что дает высокое качество РНК для анализа экспрессии генов. Свежие замороженные ткани эмбрионов мыши разделены и краткое кресиловое фиолетовое окрашивание используется для визуализации хряща и кости с цветами, отличными от окружающих тканей. Слайды затем быстро обезвоживаются, и хрящи и кости изолированы впоследствии LCM. Минимизация воздействия вавных растворов в ходе этого процесса поддерживает целостность РНК. Хрящ мыши Мекеля и мандибулярная кость на E16.5 были успешно собраны, а анализ экспрессии генов показал дифференциальное выражение генов маркеров остеобластов, остеоцитов, остеокластов и хондроцитов. Высокое качество РНК также было выделено из целого ряда тканей и эмбрионального возраста. Этот протокол детали образца подготовки для LCM в том числе криоэмбеддинг, секции, окрашивания и обезвоживания свежих замороженных тканей, а также точной изоляции хряща и кости LCM в результате чего высокое качество РНК для транскриптомического анализа.

Introduction

Опорно-крестеская система представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из мышц, соединительной ткани, сухожилия, связок, хряща и кости, иннерватизованной нервами и васкуляризованной кровеносными сосудами1. Скелетные ткани развиваются с возрастающей клеточной неоднородностью и структурной сложностью. Хрящ и кости развиваются из той же линии остеохондропрогенитора и тесно связаны между собой. Эмбриональный хрящ и кости развиваются в сочетании с мышцами, нервами, кровеносными сосудами и недифференцированным мезенхимом. Хрящ также может быть окружен кости, такие как хрящ Мекель и кондилярный хрящ в челюстно-прилежной кости. Эти ткани анатомически связаны и взаимодействуют друг с другом через внеклеточные сигналы во время развития. При изучении экспрессии генов при развитии хряща и костей одним из препятствий является неоднородность скелетных структур, состоящих из нескольких типов тканей. Точная изоляция конкретной ткани интереса является ключом к успешному транскрипционного анализа.

Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции типов клеток или регионов, представляющих интерес в неоднородных тканях, и воспроизводимый и чувствителен к одноклеточному уровню2. Он может точно цели и захвата клеток, представляющих интерес для широкого спектра вниз по течению анализы в транскриптомике, геномике и протеомике3,4. Качество изолированной РНК, ДНК или белка можно оценить с помощью биоанализа или эквивалентной платформы. Например, качество РНК указывается номером целостности РНК (RIN)5.

Здесь мы предоставляем протокол для быстрого окрашивания и изоляции хряща и кости LCM от свежих замороженных тканей. Мы используем эмбрион мыши, чтобы продемонстрировать, что этот протокол дает высококачественную РНК для последующего транскриптомического анализа, такого как секвенирование РНК (РНК-сек).

Protocol

Ткани мышей были получены в соответствии с Национальным иринститутам Здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и протоколы исследования были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета в Icahn школы медицины на горе Синай….

Representative Results

Корональные секции свежих замороженных тканей мыши на E16.5 были использованы для демонстрации изоляции и сбора хряща Мекеля (MC), кондилярного хряща и мандибулярной кости LCM. Эмбрионы мыши на E16.5 были расчленены и встроены в криогенные формы с соединением OCT. Образцы в плесенях быстро замо?…

Discussion

LCM позволяет обезолюрить обогащенные или однородные популяции клеток от неоднородных тканей. Его преимущества включают быстрый и точный захват клеток в контексте in vivo, в то время как потенциальные недостатки включают в себя его время, дорого, и ограничивается необходимостью для п?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований (R01DE022988) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD078233) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD07823). Авторы благодарят Biorepository и патологии Core для доступа к Leica LMD 6500 платформы в Icahn школы медицины на горе Синай.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O’Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -. M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used?. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Tags

Laser Capture MicrodissectionMouse Embryonic CartilageMouse Embryonic BoneGene Expression AnalysisCresyl Violet StainingRNA IntegrityCryosectioningOptimal Cutting Temperature CompoundPEN Membrane SlidesEthanolXylene
check_url/60503?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image