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Developmental Biology

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60503
, , , ,
1Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.

Abstract

A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos específicos de células ou regiões de interesse de tecidos heterogêneos. A complexidade celular e molecular de elementos esqueléticos aumenta com o desenvolvimento. A heterogeneidade tecidual, como na interface de elementos cartilaginosos e osseos uns com os outros ou com tecidos circundantes, é um obstáculo para o estudo do desenvolvimento de cartilagem e osso. Nosso protocolo fornece um método rápido de processamento de tecidos e isolamento de cartilagem e osso que produz RNA de alta qualidade para análise de expressão gênica. Os tecidos congelados frescos de embriões do rato são seccionados e a mancha violeta breve do cresyl é usada para visualizar a cartilagem e o osso com as cores distintas dos tecidos circunvizinhos. Slides são então rapidamente desidratados, e cartilagem e osso são isolados posteriormente por LCM. A minimização da exposição a soluções aquosas durante este processo mantém a integridade do RNA. A cartilagem e osso mandibular do rato Meckel na E16.5 foram coletados com sucesso e a análise da expressão gênica mostrou expressão diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e condrocitos. O RNA de alta qualidade também foi isolado de uma variedade de tecidos e idades embrionárias. Este protocolo detalha a preparação da amostra para LCM que inclui o cryoembedding, seção, coloração e desidratação de tecidos congelados frescos, e a isolação precisa da cartilagem e do osso por LCM tendo por resultado o RNA de alta qualidade para a análise transcriptomic.

Introduction

O sistema musculoesquelético é um sistema multicomponente composto de músculo, tecido conjuntivo, tendão, ligamento, cartilagem e osso, interno e vascularizado pelos vasos sanguíneos1. Os tecidos esqueléticos desenvolvem-se com o aumento da heterogeneidade celular e complexidade estrutural. Cartilagem e osso se desenvolvem a partir da mesma linhagem osteochondroprogenitor e são altamente relacionados. Cartilagem embrionária e osso se desenvolvem em associação com músculos, nervos, vasos sanguíneos e mesenchyme indiferenciado. A cartilagem também pode ser cercada por ossos, como a cartilagem de Meckel e cartilagem condylar dentro do osso mandibular. Estes tecidos são anatomicamente associados e interagem uns com os outros através de sinais extracelulares durante o desenvolvimento. No estudo da expressão gênica no desenvolvimento de cartilagem e osso, um obstáculo é a heterogeneidade de estruturas esqueléticas compostas por múltiplos tipos de tecido. O isolamento preciso do tecido específico de interesse é fundamental para uma análise transcricional bem-sucedida.

A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos, e é reproduzível e é sensível ao nível de célula única2. Ele pode precisamente alvo e capturar células de interesse para uma ampla gama de ensaios a jusante em transcriptômica, genômica e proteômica3,4. A qualidade do RNA, DNA ou proteína isolado pode ser avaliada com um bioanalisador ou plataforma equivalente. Por exemplo, a qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA (RIN)5.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para a coloração rápida e isolamento da cartilagem e osso por LCM de tecidos congelados frescos. Usamos o embrião do camundongo para demonstrar que este protocolo produz RNA de alta qualidade para análise transcriptômica subsequente, como sequenciamento de RNA (RNA-seq).

Protocol

Tecidos de camundongos foram obtidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, e protocolos de estudo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Icahn School of Medicine no Monte Sinai. 1. Preparação de espécime congelado fresco Dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorporar a amostra em um molde de incorporação descartável com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Ajuste a orientação …

Representative Results

As seções coronais de tecidos frescos do rato congelado em E16.5 foram usadas para demonstrar a isolação e a coleção da cartilagem de Meckel (MC), da cartilagem condylar, e do osso mandibular por LCM. Embriões de camundongos na E16.5 foram dissecados e embutidos em moldes criogênicos com composto OCT. As amostras nos moldes foram congeladas ràpida em um gelo seco e em um banho metil-2-butano e armazenadas em -80 °C. Para demonstrar a coloração violeta do cresyl da cartilagem e do o…

Discussion

O LCM permite o isolamento de populações de células enriquecidas ou homogêneas de tecidos heterogêneos. Suas vantagens incluem a captura rápida e precisa de células em seu contexto in vivo, enquanto as desvantagens potenciais incluem que seja demorado, caro e limitado pela necessidade de o usuário reconhecer subpopulações distintas dentro de uma amostra especificada30. Este protocolo fornece detalhes de LCM da cartilagem embrionária do rato e do osso, destacando o uso da mancha…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (R01DE022988) e pelo Instituto Nacional eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P01HD078233). Os autores agradecem ao Núcleo de Biorepositório e Patologia pelo acesso à plataforma Leica LMD 6500 na Escola de Medicina Icahn, no Monte Sinai.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736
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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).
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