Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica
Summary
Questo protocollo descrive la microdissezione di cattura laser per l’isolamento della cartilagine e dell’osso da sezioni fresche congelate dell’embrione di topo. La cartilagine e l’osso possono essere rapidamente visualizzate mediante colorazione viola cresilio e raccolte proprio per produrre RNA di alta qualità per l’analisi trascrittomica.
Abstract
La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare specifici tipi di cellule o regioni di interesse da tessuti eterogenei. La complessità cellulare e molecolare degli elementi scheletrici aumenta con lo sviluppo. L’eterogeneità dei tessuti, come l’interfaccia di elementi cartilanei e ossei tra loro o con tessuti circostanti, è un ostacolo allo studio dello sviluppo della cartilagine e dell’osso. Il nostro protocollo fornisce un metodo rapido di elaborazione dei tessuti e l’isolamento della cartilagine e dell’osso che produce RNA di alta qualità per l’analisi dell’espressione genica. I tessuti congelati freschi di embrioni di topo sono sezionato e breve colorazione viola cresyl viene utilizzato per visualizzare la cartilagine e le ossa con colori distinti dai tessuti circostanti. I vetrini vengono quindi rapidamente disidratati e la cartilagine e l’osso vengono successivamente isolati dalla LCM. La minimizzazione dell’esposizione a soluzioni acquose durante questo processo mantiene l’integrità dell’RNA. La cartilagine e l’osso mandibolare di Mouse Meckel a E16.5 sono stati raccolti con successo e l’analisi dell’espressione genica ha mostrato l’espressione differenziale dei geni marcatori per osteoblasti, osteociti, osteoclasti e condrociti. L’RNA di alta qualità è stato anche isolato da una serie di tessuti ed ere embrionali. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione del campione per LCM, tra cui crioincorporando, sezionamento, colorazione e disidratazione dei tessuti freschi congelati, e un preciso isolamento della cartilagine e dell’osso da parte di LCM, con conseguente RNA di alta qualità per l’analisi trascrittomica.
Introduction
Il sistema muscolo-scheletrico è un sistema multicomponente composto da muscoli, tessuto connettivo, tendine, legamento, cartilagine e ossa, innervato dai nervi e vascolarizzato dai vasi sanguigni1. I tessuti scheletrici si sviluppano con una crescente eterogeneità cellulare e complessità strutturale. Cartilagine e ossa si sviluppano dallo stesso lignaggio dell’osteochondroprogenitor e sono altamente correlati. La cartilagine embrionale e l’osso si sviluppano in associazione con muscoli, nervi, vasi sanguigni e mesenchyme indifferenziato. La cartilagine può anche essere circondata da ossa, come la cartilagine di Meckel e la cartilagine condilar all’interno dell’osso mandibolare. Questi tessuti sono associati anatomicamente e interagiscono tra loro attraverso segnali extracellulari durante lo sviluppo. Nello studio dell’espressione genica nello sviluppo della cartilagine e dell’osso, un ostacolo è l’eterogeneità delle strutture scheletriche composte da più tipi di tessuto. L’isolamento preciso del tessuto specifico di interesse è fondamentale per un’analisi trascrizionale di successo.
La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare i tipi di cellule o le regioni di interesse all’interno di tessuti eterogenei, ed è riproducibile ed è sensibile al livello a singola cellula2. Può colpire e catturare con precisione le cellule di interesse per una vasta gamma di analisi a valle in trascrittomica, genomica e proteomica3,4. La qualità dell’RNA, del DNA o della proteina isolata può essere valutata con un bioanalisi o una piattaforma equivalente. Ad esempio, la qualità dell’RNA è indicata dal numero di integrità dell’RNA (RIN)5.
Qui, forniamo un protocollo per la rapida colorazione e isolamento della cartilagine e dell’osso da LCM da tessuti freschi congelati. Usiamo l’embrione di topo per dimostrare che questo protocollo produce RNA di alta qualità per la successiva analisi trascrittomica, come il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq).
Protocol
Representative Results
Discussion
LCM consente l’isolamento di popolazioni cellulari arricchite o omogenee da tessuti eterogenei. I suoi vantaggi includono la cattura rapida e precisa delle cellule nel loro contesto in vivo, mentre i potenziali svantaggi includono che richiede tempo, costoso e limitato dalla necessità per l’utente di riconoscere sottopopolazioni distinte all’interno di un campione specificato30. Questo protocollo fornisce dettagli di LCM della cartilagine embrionale e dell’osso del topo, evidenziando l’u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) e dall’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Gli autori ringraziano il Biorepository e Pathology Core per l’accesso alla piattaforma Leica LMD 6500 presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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