JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60503
, , , ,
1Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Abstract

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokulardan belirli hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır. İskelet elemanlarının hücresel ve moleküler karmaşıklığı gelişme ile birlikte artar. Doku heterojenliği, birbirleriyle veya çevre dokularla kıkırdak ve kemik gelişen çalışma için bir engel dir. Protokolümüz, gen ekspresyonu analizi için yüksek kaliteli RNA sağlayan kıkırdak ve kemiğin doku işleme ve izolasyonhızlı bir yöntem sağlar. Fare embriyolarının taze dondurulmuş dokuları kesitli ve kısa tere mor boyama çevreleyen dokulardan farklı renklerle kıkırdak ve kemik görselleştirmek için kullanılır. Slaytlar daha sonra hızla susuz, ve kıkırdak ve kemik lcm tarafından daha sonra izole edilir. Bu işlem sırasında sulu çözeltilere maruz kalmanın en aza inmesi RNA bütünlüğünü korur. Mouse Meckel’in E16.5’teki kıkırdağı ve mandibuler kemiği başarılı bir şekilde toplanmış ve gen ekspresyonu analiziosteoblastlar, osteositler, osteoklastlar ve kondrositler için marker genlerin diferansiyel ekspresyonu göstermiştir. Yüksek kaliteli RNA da dokular ve embriyonik çağlar bir dizi izole edildi. Bu protokol, kriyoksasyon, kesitleme, boyama ve taze dondurulmuş dokuların susuz kalması ve kıkırdak ve kemiğin LCM ile hassas izolasyonu gibi LCM için numune hazırlamasını ayrıntılarıyla belirterek transkripskopik analiz için yüksek kaliteli RNA sağlar.

Introduction

Kas-iskelet sistemi kas, bağ dokusu, tendon, bağ, kıkırdak ve kemik, sinirler tarafından innerve ve kan damarları tarafından vaskülarize oluşan çok bileşenli bir sistemdir1. İskelet dokuları artan hücresel heterojenlik ve yapısal karmaşıklık ile gelişir. Kıkırdak ve kemik aynı osteokondroprojenitor soydan gelişir ve son derece ilişkilidir. Embriyonik kıkırdak ve kemik kaslar, sinirler, kan damarları ve farklılaşmamış mezenkim ile birlikte gelişir. Kıkırdak da kemik ile çevrili olabilir, Meckel kıkırdak ve mandibuler kemik içinde kondize kıkırdak gibi. Bu dokular anatomik olarak ilişkilidir ve gelişim sırasında hücre dışı sinyaller aracılığıyla birbirleriyle etkileşime geçerler. Kıkırdak ve kemik gelişiminde gen ekspresyonunun incelenmesinde, birden fazla doku tipinden oluşan iskelet yapılarının heterojenliği bir engeldir. İlgi dokusunun hassas izolasyonu başarılı transkripsiyonel analiz için anahtardır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokular içinde hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır, ve tekrarlanabilir ve tek hücre seviyesine duyarlı2. Bu kesin hedef ve transkriptomik, genomik ve proteomik3,4downstream tahliller geniş bir yelpazede için ilgi hücreleri yakalamak . İzole RNA, DNA veya proteinin kalitesi biyoanalizör veya eşdeğer bir platform ile değerlendirilebilir. Örneğin, RNA kalitesi RNA bütünlük numarası (RIN)5ile gösterilir.

Burada, taze dondurulmuş dokulardan LCM tarafından kıkırdak ve kemik hızlı boyama ve izolasyon için bir protokol sağlar. Fare embriyosu kullanarak bu protokolün rna dizilemesi (RNA-seq) gibi sonraki transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verdiğini gösteriyoruz.

Protocol

Farelerden elde edilen dokular, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Sağlık Enstitüleri Rehberi’ne uygun olarak elde edildi ve çalışma protokolleri Sina Dağı’ndaki Icahn Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. 1. Taze Dondurulmuş Numunenin Hazırlanması Embriyoyu veya ilgi çekici dokuyu inceleyin. Numuneyi en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle tek kullanımlık gömme kalıbına gömün. Numunenin …

Representative Results

E16.5’teki taze dondurulmuş fare dokularının koronal bölümleri, Meckel’in kıkırdağının (MC), aküler kıkırdağının ve mandibular kemiğinLCM ile izolasyon ve toplanmasını göstermek için kullanıldı. E16.5’teki fare embriyoları parçalandı ve OCT bileşiği ile kriyojenik kalıplara gömülmüştü. Kalıptaki numuneler kuru buz ve metil-2-bütan banyosunda hızla dondurularak -80 °C’de saklandı. Kıkırdak ve kemik terosmor mor boyama göstermek için koronal düzlemde k…

Discussion

LCM, zenginleştirilmiş veya homojen hücre popülasyonlarının heterojen dokulardan izole edilmesini sağlar. Avantajları arasında hücrelerin in vivo bağlamında hızlı ve hassas bir şekilde yakalanması yer alırken, potansiyel dezavantajları arasında zaman alıcı, pahalı ve kullanıcının belirli bir örnek30içinde farklı alt popülasyonları tanıma ihtiyacı yla sınırlı olması yer almaktadır. Bu protokol fare embriyonik kıkırdak ve kemik LCM ayrıntılarını sa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (R01DE022988) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsanGelişimi Enstitüsü (P01HD078233) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Mount Sinai De Icahn Tıp Okulu’nda Leica LMD 6500 platformuna erişim için Biorepository ve Patoloji Çekirdek teşekkür ederiz.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O’Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -. M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used?. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Tags

Laser Capture MicrodissectionMouse Embryonic CartilageMouse Embryonic BoneGene Expression AnalysisCresyl Violet StainingRNA IntegrityCryosectioningOptimal Cutting Temperature CompoundPEN Membrane SlidesEthanolXylene
check_url/60503?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image