الجسيمات الحيوية Microarrays للتحليل الكيميائي والجزيئي للالعدلة البشرية يحتشدون في المختبر
Summary
يولد هذا البروتوكول ميكروصفات الجسيمات الحيوية التي توفر الحينة الخاضعة للرقابة المكانية تحت الإحتلال. فهو يوفر سهولة الوصول إلى الوسطاء الذين تطلقهم العدلات أثناء الترحيل ويسمح بتحليل التصوير الكمي.
Abstract
العدلات يحتشدون هي عملية تعاونية من خلالها العدلات ختم موقع للعدوى وتعزيز إعادة تنظيم الأنسجة. وقد درس يحتشدون تقليديا في الجسم الحي في نماذج الحيوانات التي تظهر أنماط مميزة من هجرة الخلايا. ومع ذلك، في نماذج الجسم الحي لديها العديد من القيود، بما في ذلك الوسطاء بين الخلايا التي يصعب الوصول إليها وتحليلها، فضلا عن عدم القدرة على تحليل العدلات البشرية مباشرة. وبسبب هذه القيود، هناك حاجة إلى منصة في المختبر التي تدرس يحتشدون مع العدلات البشرية ويوفر سهولة الوصول إلى الإشارات الجزيئية التي تم إنشاؤها أثناء الحشود. هنا ، يتم استخدام عملية ختم دقيق متعدد الخطوات لتوليد ميكروريسالجسيمات الحيوية التي تحفز الاحترار عن طريق محاكاة عدوى في الجسم الحي. تحفز الميكروسير اتافيليات الجسيمات الحيوية على السرب بطريقة مُتحكَّم ة ومستقرة. على الميكروarray ، العدلات زيادة في السرعة وتشكيل أسراب مستقرة حول مجموعات الجسيمات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل supernatant التي ولدتها العدلات وتم اكتشاف 16 بروتينا تم التعبير عنها بشكل تفاضلي على مدى يحتشدون. هذا في المختبر يحتشدون منصة يسهل التحليل المباشر للهجرة العدلات وإطلاق البروتين بطريقة قابلة للاستنساخ، وتسيطر عليها مكانيا.
Introduction
العدلات، وخلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة في مجرى الدم1،تكتسب الاهتمام كأهداف التشخيص والعلاج المحتملة2،3 لأنها قد تشارك في مجموعة متنوعة من الحالات الطبية بما في ذلك النقرس4،تعفن الدم3،الصدمة5،6،السرطان1،7،8،ومختلف أمراض المناعة الذاتية5،9. العدلات يحتشدون هو متعدد المراحل، عملية منظمة بإحكام مع التعقيد الذي يجعلهامحور اهتمام خاص من الدراسة5،10،11. أثناء الإحتباس ، تعزل العدلات موقع الالتهاب من الأنسجة السليمة المحيطة5،10،11. التنظيم السليم للجنوماتر يحتشدون ضروري لتعزيز التئام الجروح والتهاب القرار في نهاية المطاف5،12. وقد درس في المقام الأول الاحترار العدلات في الجسم الحي في القوارض12،13،14،15 وحمار وحشي10،11،12،15 نماذج. ومع ذلك ، فإن طبيعة هذه النماذج الحيوانية في الجسم الحي تؤدي إلى قيود5. على سبيل المثال ، الوسطاء التي أفرج عنها العدلات أثناء الاحتباس ليست متاحة بسهولة للتحليل5. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من المصادر المحتملة لوسيط معين في الجسم الحي ، لذلك يجب أن تدخل تجربة الجسم الحي نقصًا وراثيًا لمنع الإنتاج الخلوي و / أو التفاعل من أجل التحقيق في دور ذلك الوسيط في عملية معينة13. تتحايل تجربة المختبر على هذه المضاعفات من خلال تمكين مراقبة العدلات دون سياق خلايا إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البحوث التي تصف الهجرة المنسقة العدلات البشرية محدودة16. على منصة في المختبر يحتشدون، يمكن تحليل العدلات البشرية مباشرة. ويمكن لمنصة في المختبر يحتشدون توسيع نطاق المعرفة المكتسبة من الدراسات في الجسم الحي من خلال توفير الفرص لسد الثغرات التي خلفتها القيود المفروضة في دراسات الجسم الحي.
ولتلبية الحاجة إلى منصة في المختبر تحاكي في الحي الحي ّدات، قمنا بتطوير منصة ختم دقيقة تمكننا من نقش الجسيمات الحيوية الدقيقة التي تحفز العدلات تحت الحشود بطريقة خاضعة للرقابة المكانية. نحن توليد microarrays الجسيمات الحيوية على الشرائح الزجاجية في عملية من خطوتين. أولا، نحن نستخدم الختم الدقيق لتوليد ميكرور من البولي كتروليليت الموجبة (CP) البقع. ثانيا، نضيف حلا من الجسيمات الحيوية التي تلتزم البقع CP عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي. من خلال أول نقش طبقة CP ، يمكننا نمط الجسيمات الحيوية المشحونة بشكل سلبي بشكل انتقائي لتوليد نمط الشد العدلات المطلوب. الطبقة المشحونة إيجابيا يحمل الجسيمات الحيوية المشحونة سلبا من خلال خطوة الغسيل القوية التي تزيل الجسيمات الحيوية من المناطق على الشريحة الزجاجية التي لا تحتوي على CP. بالإضافة إلى ذلك، CP المستخدمة هنا، copolymer من الأكريلاميد وأحادي المقط الرباعي، هو متوافق بيولوجيا، لذلك فإنه لا يحفز استجابة من العدلات. لديها شحنة سطحية عالية جدا ً تقوم بشل الجسيمات الحيوية بحجم الميكرون إلى الشريحة الزجاجية ، وبالتالي تمنع العدلات من إزالة الجسيمات من الموضع المنقوش على الشريحة الزجاجية. وهذا يؤدي إلى مجموعات الجسيمات الحيوية مرتبة في ميكروarray. عندما أضفنا العدلات إلى المايكروفير، شكلوا أسراب مستقرة حول مجموعات الجسيمات الحيوية. من خلال تتبع هجرة العدلات ، وجدنا أن العدلات المحتشدة تهاجر بنشاط نحو مجموعات الجسيمات الحيوية. وعلاوة على ذلك، استخدمنا هذه المنصة لتحليل بعض الوسطاء الذين تطلقهم العدلات أثناء الإحتلال. لقد وجدنا 16 وسيطاً يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي أثناء الحشود. وتتبع تركيزاتها ثلاثة اتجاهات عامة على مر الزمن: الزيادة أو النقصان أو الارتفاع. لدينا في المختبر العدلات منصة يحتشدون يسهل تحليل العدلات البشرية التي تسيطر عليها مكانيا يحتشدون، فضلا عن جمع وتحليل الوسطاء الصادرة عن العدلات يحتشدون. في منشور سابق ، أثبتنا أن المرضى الذين يعانون من حالات طبية معينة (الصدمة ، وأمراض المناعة الذاتية ، والإنتان) ، لديهم العدلات التي تعمل بشكل مختلف عن تلك من المتبرعين الأصحاء5. في الدراسات البحثية المستقبلية، يمكن استخدام منصتنا لتحليل وظيفة العدلات بين مجموعة متنوعة من مجموعات المرضى. يمكن لهذه المنصة تحليل كمي للتنسيق المعقد الذي ينطوي عليه التَّلَّشّي في العدلات. يمكن إجراء دراسات إضافية لتوفير نظرة ثاقبة على وظيفة العدلات لمريض معين من السكان أو استجابة العدلات لمسببات الأمراض ذات الأهمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير منصة الختم الدقيق لتوليد صفائف موحدة من الجسيمات الحيوية لتحفيز في المختبر العدلات يحتشدون. طبيعة المختبر من منصتنا يسمح لنا للتحايل على المضاعفات التي تنشأ مع في التجارب يحتشدون في الجسم الحي، وهي ضعف القدرة على تحليل الوسطاء الصادرة عن العدلات يحتشدون5. بالإضا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل من قسم ويليام ج. لوري للهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية ومركز السرطان الشامل في جامعة ولاية أوهايو. جاءت البيانات الواردة في هذا التقرير من الصور التي تمت معالجتها باستخدام Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) المتاحة في مرفق المجهر والتصوير في الحرم الجامعي ، جامعة ولاية أوهايو. ويدعم هذا المرفق جزئيا من قبل منحة P30 CA016058، المعهد الوطني للسرطان، Bethesda، دكتوراه في الطب.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
