ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים
Summary
פרוטוקול זה יוצר מיקרו-מערכים ביוביופית המספקים שורצים בעלי מליטה באמצעות הספפיל. הוא מספק גישה קלה למגשרים כי נויטרופילים שחרור במהלך הגירה ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית.
Abstract
נויטרופילים שורצים הוא תהליך משותף שבו נויטרופילים לאטום את אתר של זיהום ולקדם התארגנות רקמות. המונים נחקרו באופן קלאסי בvivo בדגמי בעלי חיים המציגים דפוסים אופייניים של נדידת תאים. עם זאת, במודלים vivo יש מספר מגבלות, כולל מגשרים אינטרתאיים שקשה לגשת ולנתח, כמו גם חוסר יכולת לנתח במישרין את הנויטרופילים האנושיים. בגלל מגבלות אלה, יש צורך בפלטפורמת מבחנה כי מחקרים שורצים עם נויטרופילים האדם ומספק גישה קלה האותות המולקולריים שנוצרו במהלך שורצים. בשלב זה, משתמשים בתהליך מיקרו-מעבדים מרובה-צעדים כדי ליצור מיקרוarray של מאמר ביוגרפי, המעוררת שורצים בvivo זיהום. ביוביומאמר microarray גורם נויטרופילים נחיל בצורה מבוקרת ויציבה. על מיקרוarray, העלייה נויטרופילים במהירות וליצור נחילים יציבים סביב אשכולות מאמר ביוגרפי. בנוסף, supernatant שנוצר על ידי נויטרופילים נותחו ו 16 חלבונים התגלו להתבטא באופן מהותי במהלך שורצים. זה בפלטפורמת מתורבת שורצים מקלה ניתוח ישיר של הגירה נויטרופילים ושחרור חלבון באופן שאינו מפוקח, בצורה מבוקרת מרחב.
Introduction
נויטרופילים, הנפוץ ביותר של תא דם לבן במחזור הדם1, הם צוברים תשומת לב כמטרות אבחון וטיפול פוטנציאלי2,3 כי הם עשויים להיות מעורבים במגוון של מצבים רפואיים כולל שיגרון4, אלח דם3, טראומה5,6, סרטן1,7,8, מחלות אוטואימוניות שונים5,9. נויטרופילים שורצים היא מרובת השלבים, תהליך מוסדר בחוזקה עם מורכבות זה עושה את זה מוקד מעניין במיוחד של לימוד5,10,11. במהלך שורצים, נויטרופילים לבודד אתר של דלקת מתוך רקמות בריאות שמסביב5,10,11. התקנה הנכונה של נויטרופילים שורצים חיוני כדי לקדם ריפוי הפצע בסופו של דבר החלטה דלקת5,12. נויטרופילים שורצים נחקרו בעיקר בשנת vivo ב מכרסם12,13,14,15 ו דג הזברפיש10,11,12, 15 מודלים . עם זאת, הטבע של אלה בדגמי בעלי חיים vivo מעניקה מגבלות5. לדוגמה, המגשרים שפורסמו על ידי נויטרופילים במהלך שורצים אינם נגישים בקלות לניתוח5. בנוסף, ישנם מקורות פוטנציאליים רבים עבור מתווך נתון vivo, כך בניסוי vivo חייב להחדיר מחסור גנטי כדי לעכב את הייצור הסלולר ו/או אינטראקציה כדי לחקור את התפקיד של המגשר הזה בתהליך נתון13. על ידי הפעלת התבוננות נויטרופילים ללא ההקשר של תאים נוספים. בנוסף, מחקר המתאר נויטרופילים האדם הגירה מתואמת הוא מוגבל16. על הפלטפורמה שורצים מתורבת, נויטרופילים האדם יכול להיות מנותח ישירות. פלטפורמת שורצים מבחנה יכולה להתרחב על הידע שנרכש במחקרים vivo על ידי מתן הזדמנויות למלא את הפערים שנותרו על ידי מגבלות במחקרים vivo.
כדי לטפל בצורך בפלטפורמת מבחנה המחקה ב vivo נויטרופילים שורצים, פיתחנו פלטפורמת מיקרוהטבעה המאפשרת לנו דפוס ביופסיה מאמר מיקרו מערכים המעוררים נויטרופילים שורצים באופן מבוקר מרחב. אנו יוצרים מיקרוערכים ביוביומאמר על מגלשות זכוכית בתהליך דו-שלבים. ראשית, אנו משתמשים במיקרו-הטבעה כדי ליצור מיקרו מערך של כתמי פוליאלקטרוליט (CP). שנית, אנו מוסיפים פתרון של מאמרים הנצמדים לנקודות CP באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית. על-ידי הראשון מעורר את שכבת CP, אנחנו יכולים באופן סלקטיבי דפוס מאמרים טעונה באופן שלילי על מנת ליצור את התבנית הרצויה נויטרופילים שורצים. השכבה טעונה באופן חיובי מחזיקה את מאמרים ביוטעונים שלילית באמצעות השלב השוטף הנמרץ המסיר את מאמרי הביויולים מהאזורים בשקופית הזכוכית שאין להם את ה-cp. בנוסף, cp השתמשו כאן, סופולימר של אקרילאמיד ו-מונומר מונומר, הוא ביו תואם, אז זה לא לגרום ל יש לו טען משטח גבוה מאוד כי משתק את מאמרי ביוביומיקרון בגודל בינוני לשקופית זכוכית, ובכך מעכב נויטרופילים להסיר את החלקיקים מהמיקום בתבנית על שקופית זכוכית. התוצאה היא אשכולות ביוביומאמרים המסודרים במיקרו-מערך. כאשר הוספנו נויטרופילים למיקרו-מערך, הם יצרו נחילים יציבים סביב האשכולות של המאמרים. באמצעות מעקב הגירה נויטרופילים, מצאנו כי שורצים באופן פעיל להגר לכיוון אשכולות המאמרים ביופסיה. יתר על כן, השתמשנו בפלטפורמה זו כדי לנתח מגשרים מסוימים שחרור נויטרופילים במהלך שורצים. מצאנו 16 מגשרים שמתבטאים באופן מכריע בזמן שורצים. הריכוזים שלהם לעקוב אחר שלוש מגמות כלליות לאורך זמן: להגדיל, להקטין, או ספייק. שלנו בפלטפורמת מבחנה שורצים הפלטפורמה מקלה על ניתוח של שליטת נויטרופילים האדם מבוקרת, כמו גם את האוסף וניתוח של מגשרים שפורסמו על ידי נויטרופילים שורצים. בפרסום קודם, הדגמנו כי חולים עם מצבים רפואיים מסוימים (טראומה, מחלות אוטואימוניות, ו אלח דם), היו נויטרופילים שפעלו באופן שונה מאלה תורמים בריאים5. במחקרי מחקר עתידיים, הפלטפורמה שלנו יכול לשמש לניתוח הפונקציה נויטרופילים בקרב מגוון רחב של אוכלוסיות החולה. פלטפורמה זו יכולה לנתח את הקואורדינציה המורכבת הכרוכה בנויטרופילים שורצים. מחקרים נוספים ניתן לעשות כדי לספק תובנה על הפונקציה נויטרופילים של אוכלוסיית החולה ספציפית או תגובת נויטרופילים לפתוגן של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו מיקרורקיעת הפלטפורמה כדי ליצור מערכים אחידים של ביויוטיפים כדי לגרות בתוך מבחנה שורצים. הטבע מתורבת של הפלטפורמה שלנו מאפשר לנו לעקוף את הסיבוכים הנובעים עם vivo שורצים ניסויים, כלומר היכולת המסכנה לנתח מגשרים שפורסמו על ידי שורצים נויטרופילים5. בנוסף, ב vivo מודלים מבוצע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מימון של ויליאם G. Lowrie המחלקה להנדסה כימית ביוקולקלית ואת מרכז הסרטן המקיף באוניברסיטת אוהיו. הנתונים המוצגים בדו ח זה הגיעו מתמונות שעובדו באמצעות מיכל x64 (ver. 9.3.0 Bitplane טוס) זמין במכון המיקרוסקופיה של הקמפוס והדמיה, האוניברסיטה הממלכתית של אוהיו. מתקן זה נתמך בחלקו על ידי גרנט P30 CA016058, המכון הלאומי לסרטן, בת, MD.
Materials
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software – Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 – 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm–navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics – Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
