Summary
O objetivo deste protocolo é detalhar um novo método para a avaliação da função cardíaca segmental em zebrafish embrionário sem condições fisiológicas e patológicas.
Abstract
Os zebrafish são cada vez mais utilizados como um organismo modelo para cardiomiopatias e regeneração. Os métodos atuais que avaliam a função cardíaca não detectam de forma confiável a mecânica segmental e não são facilmente viáveis em zebrafish. Aqui apresentamos um método semiautomatizado de código aberto para a avaliação quantitativa da função cardíaca segmental tetradimensional (4D): análise de deslocamento da deformação mecânica do miocárdio (DIAMOND). Zebrafish embrionário transgênico foram imagens in vivo usando um sistema de microscopia de fluorescência de folha de luz com sincronização de movimento cardíaco 4D. Corações digitais 3D adquiridos foram reconstruídos em systole final e diastole final, e o ventrículo foi segmentado manualmente em conjuntos de dados binários. Em seguida, o coração foi reorientado e isotropicalmente reamostrado ao longo do verdadeiro eixo curto, e o ventrículo foi dividido uniformemente em oito porções (I-VIII) ao longo do eixo curto. Devido aos diferentes aviões de reamostragem e matrizes em matrizes de fim de systole e diastole final, foi aplicada uma matriz de transformação para registro de imagem para restaurar a relação espacial original entre as matrizes de imagem sistólica reamostrada e diastólica. Após o registro de imagem, o vetor de deslocamento de cada segmento de systole final para diastole final foi calculado com base no deslocamento de centrosids de massa em três dimensões (3D). Diamond mostra que os segmentos basais do miocárdio adjacentes ao canal arioventricular passam pela maior deformação mecânica e são os mais suscetíveis à lesão cardíaca induzida por doxorubicina. No geral, a DIAMOND fornece novas percepções sobre a mecânica cardíaca segmental em embriões de zebrafish além da fração tradicional de ejeção (EF) em condições fisiológicas e patológicas.
Introduction
A toxicidade cardíaca induzida pela quimioterapia e a insuficiência cardíaca que se seguiu são uma das principais razões para a descontinuação da quimioterapia1. Portanto, a avaliação funcional cardíaca desempenha um papel crucial na identificação da toxicidade cardíaca e, mais importante, na previsão de lesão cardíaca precoce após a quimioterapia2. No entanto, as abordagens atuais para limitações de avaliação funcional cardíaca encontram limitações. Métodos como a fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF) fornecem apenas mecânica cardíaca global e muitas vezes retardada após lesão3,4. A imagem do Tissue Doppler fornece informações segmentais de deformação do miocárdio, mas sofre de significativa variabilidade intraobservador e interobservador, em parte devido à dependência do ângulo do feixe de ultrassom5. O rastreamento bidimensional (2D) utiliza o modo B de ecocardiografia, que teoricamente elimina a dependência do ângulo, mas sua precisão é limitada pelo movimento fora do plano6. Portanto, falta uma abordagem rigorosa para quantificar a função cardíaca segmental tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos.
Nesse contexto, desenvolvemos um método de quantificação 4D para a análise da função cardíaca segmentada que nomeamos a análise de deslocamento da deformação mecânica miocárdica (DIAMOND), para determinar os vetores de deslocamento de centrosides de massa miocárdica no espaço 3D. Aplicamos DIAMOND para a avaliação in vivo da função cardíaca e toxicidade cardíaca induzida por doxorubicina com zebrafish(Danio rerio) como modelo animal, escolhido devido ao seu miocárdio regenerador e genes de desenvolvimento altamente conservados7. Comparamos ainda o deslocamento segmental diamond com determinação da fração de ejeção global (EF) e cepa 2D após o tratamento da doxorubicina. Ao integrar o deslocamento DIAMOND com microscopia fluorescente de folha de luz 4D (LSFM) adquirida renderização de corações de zebrafish embrionários, diamond mostra que os segmentos basais miocárdio adjacentes ao canal arioventricular passam pela maior deformação mecânica e são os mais suscetíveis à lesão cardíaca aguda doxorubicina8.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCLA (IACUC), e os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Escritório de Pesquisa Animal da UCLA.
1. Reprodução Tg (cmlc2:mCherry) zebrafish e coleta de embriões
- Siga os procedimentos de moradia, reprodução e coleta de embriões descritos em práticas de pecuária e reprodução previamente estabelecidas. Para mais detalhes, consulte Messerschmidt et al.9.
- Trate os embriões coletados com 0,003% 1-phenill-2-thiourea (UPT) na E3 médio 18 h pós-fertilização para manter a transparência dos embriões para a imagem LSFM.
2. Tratamento de doxorubicina para induzir lesão cardíaca
- Aos 3 dias de pós-fertilização (dpf), tratar os embriões com doxorubicina a uma concentração de 10 μM em água de peixe E3. Após um tratamento de 24 h para 4 dpf, substitua o meio de doxorubicina por meio E3 fresco.
ATENÇÃO: Doxorubicina é um medicamento para quimioterapia. É necessário equipamentos de proteção individual adequados (EPE) e os resíduos devem ser descartados em recipientes de resíduos de risco biológico.
3. Modulação de caminho de entalhe
- Trate embriões de zebrafish com o inibidor de via notch (2S)-N-[(3,5-difluorofpheníl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glicina 1,1-dimetiletiletil (DAPT) em uma concentração de 10 μM em água de peixe E3 média de 3-6 dpf.
- Microinjetando os efeitos notch a jusante Notch Domínio intracelular (NICD) e Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA em concentrações de 10 pg/nL e 5 pg/nL, respectivamente, nos embriões de zebrafish estágio 1 células8,10.
NOTA: A microinjeção é realizada um microscópio com o suporte de uma bomba de ar para controlar com precisão o volume injetado. A microinjeção mRNA na célula é feita quando o óvulo fertilizado está no estágio inicial da célula. Para obter detalhes sobre a preparação e sequência dos mRNAs, consulte Chen et al.8. Para obter detalhes sobre a microinjeção e preparação de agulhas de injeção, consulte Rosen et al.10.
4. Sincronização de imagem LSFM e sincronização pós-imagem
- Para as técnicas de imagem LSFM e algoritmo de sincronização pós-imagem, veja detalhes em publicações anteriores9,11.
NOTA: Brevemente, nosso sistema utiliza um laser de onda contínua como fonte de iluminação para visualizar todas as linhas transgênicas de zebrafish. O módulo de detecção é composto por duas câmeras científicas complementares de óxido metálico (sCMOS) e dois conjuntos de filtros para imagens de dois canais. O módulo de detecção é instalado perpendicularmente no plano de iluminação. Cada quadro LSFM é adquirido dentro de um tempo de exposição de 20 msec, enquanto o poder de resolução na seção transversal é de ~0,65 μm e o tamanho do passo entre quadros consecutivos é de ~2 μm. Um laser de 589 nm foi usado para excitar sinais fluorescentes mCherry.
5. Reconstrução do coração sistólico e diastólico 3D
- Abra a pasta criada pelo algoritmo de sincronização pós e abra a pasta "Saída". Selecione o plano do meio do coração e carregue toda a pasta no ImageJ. Encontre a primeira fase diastólica e sistólica e grave o número do quadro.
- Abra a pasta "Saída/Por Estado" e encontre as pastas que tenham os mesmos números que os números do quadro acabaram de ser registrados. Converta as imagens na pasta em arquivos 3D TIFF (formato de arquivo de imagem marcado) e as nomeie "diastole.tif" e "systole.tif".
6. Segmentação do ventrículo
- Abra o software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais). Clique em Arquivo | Abra dadose carregue "diastole.tif" e "systole.tif". Digite o tamanho voxel de acordo com as configurações de imagem.
NOTA: Para o sistema LSFM utilizado, o tamanho típico do voxel é de 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm. - Clique no painel "SEGMENTAÇÃO" e segmente manualmente a parte de ventrículo do coração. A ferramenta"Limiar"incorporada que pode selecionar todas as regiões acima de uma certa intensidade pode facilitar esse processo. O ventrículo é a câmara mais grossa com uma fluorescência mais forte.
NOTA: Certifique-se de remover o canal arioventricular e o trato de saída no ventrículo segmentado, pois isso afeta a análise de deslocamento. - Depois que a segmentação for feita, clique no painel "Projeto". Clique direito no "diastole. Labels.tif" e "systole. Labels.tif" guias no console e clique em "Exportar Dados como" para salvar os dados como arquivos 3D TIFF.
7. Criação de paralelos retangulares para registro de imagem
- Execute "prepImage_1.m" no ambiente de programação (ver Tabela de Materiais). Abra "prepImage_1.m", "ImPath" na linha 5 para que a pasta contenha os arquivos TIFF originais e segmentados, e mude "fatia" na linha 4 para o número de fatias dos arquivos 3D tif.
- Após a execução do código, ele gerará cinco novos arquivos 3D TIFF ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" e "sysLabel200.tif"), bem como duas novas pastas ("resample_dia" e "resample_sys").
8. Reamostrar corações sistólicos e diastólicos 3D ao longo do plano de eixo curto
- Importe todos os cinco arquivos 3D TIFF no software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O tamanho voxel é inalterado. - Vá para o painel MULTIPLANAR. Escolha "diastole_200.tif" como dados primários. Alinhe o eixo X (a linha verde no plano XY) com o eixo longo vertical do ventrículo, e alinhe o eixo Z (a linha vermelha no plano YZ) com o eixo longo horizontal do ventrículo.
NOTA: O eixo longo vertical é determinado encontrando o eixo mais longo que conecta o ápice e o trato de saída no plano XY, e o eixo longo horizontal é determinado encontrando o eixo mais longo que conecta o ápice e o trato de saída no plano YZ. Gire o eixo colocando o cursor na extremidade do eixo. - Escolha três pontos aleatórios do oblíquo avião YZ (o plano de eixo curto) de forma anti-horário e registre suas coordenadas de posição 3D.
NOTA: Certifique-se de que os pontos sejam escolhidos de forma anti-horário. - Repita as etapas 8.2 e 8.3 para "systole_200.tif".
- Clique no painel "PROJECT". Crie um objeto "Slice" para "diastole_200.tif" clicando à direita em "diastole_200.tif" e procurando por "Slice" objeto. Clique à esquerda no objeto Slice apenas criado, e no painel Propriedades | Opções, verifique "Set Plane" e escolha três pontos em " Definiçãode Avião". Digite as coordenadas dos três pontos da etapa 7.3.
- Repita o passo 8.5 para "systole_200.tif".
NOTA: O objeto de fatia criado deve ter o nome "Fatia 2". - Clique direito em "diastole_200.tif" e procure "Resample Transformed Image" e crie o objeto. No painel Propriedades, escolha "Fatia" como a "Referência" e clique em Aplicar. Isso deve gerar um objeto chamado "diastole_200.transformado".
- Clique direito "diastole_200.transformado" e procure por "Resample" e crie o objeto. Escolha "Tamanho Voxel" como o "Modo" e mude "Tamanho Voxel" para ser x = 1, y = 1 e z = 1 no painel Propriedades.
- Clique em aplicar "inscreva-se". Isso deve gerar um objeto chamado "diastole_200.reamostrado". Clique direito em "diastole_200.resampled" e salve-o como um arquivo 3D TIFF.
- Repita o mesmo passo para "diaLabel.tif" e "test.tif". Salve "diaLabel.resampled" e "test.resampled" como arquivos 3D TIFF. Repita o mesmo passo para "systole_200.tif", "sysLabel.tif" e "test.tif" usando "Slice 2" como referência, e salve "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" e "test2.resampled" como arquivos 3D TIFF.
NOTA: Certifique-se de que há um total de seis arquivos TIFF salvos nesta etapa.
9. Divisão do coração reamostrado
- Importe todos os seis arquivos reamostrados da etapa 8 para o ImageJ. Selecione uma fatia de "systole_200.resampled" na qual o canal arioventricular é claramente visualizado. Registre o número da fatia.
- Use a "Imagem | Transformar | Gire" função do ImageJ para que o canal arioventricular seja vertical. Aplique a mesma rotação a todos os arquivos. Feche todas as janelas e salve todas as mudanças.
- Mova "diastole_200.resampleado", "diaLabel.resampled" e "test.resampled" para a pasta "resample_dia" e mova "systole_200.resampleado", "sysLable.resampled" e "test2.resampled" para a pasta "resample_sys".
- Abra "divider_2_8_pieces.m". Mude "ImPath" na linha 5 e "ImPath" na linha 395 para o diretório de imagem. Altere a variável "Middle" na linha 22 e linha 411 para os números de fatias onde o canal arioventricular é claramente visualizado em "systole_200.resampleado" e "diastole_200.resampled".
- Execute o código e nas janelas solicitadas clique uma vez no centro do ventrículo e clique uma vez no centro do canal atrioventricular. Isso precisa ser feito duas vezes para imagens de systole e diastole.
10. Registro de matrizes de imagem sistólica e diastólica
- Abra "register_3.m" e mude "ImPath"na linha 4 para o caminho da pasta de imagem. Pode levar de 5 a 20 min para executar este código dependendo do poder de computação do sistema.
NOTA: Os paralelos retangulares criados artificialmente na etapa 7 são utilizados para registro rígido 3D que preserva a distância entre dois pontos e ângulos subscritos por três pontos. Quando o paralelo retangular de diastole final é registrado na matriz paralela retangular (verde) (verde), a localização 3D discrepant resultante permite a derivação de uma matriz única de transformação rígida que consiste em rotação e tradução da matriz de diastole final para a matriz de systole final(Figura 1H). Realizamos o registro e minimizamos energia regularizada para desfazer a matriz após a transformação utilizando uma caixa de ferramentas de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais). Para uma descrição matemática detalhada, consulte Chen et al.8.
11. Saída dos vetores de deslocamento
- Abra "displacement_4.m" e mude "ImPath" na linha 4 para o caminho da pasta de imagem.
- Execute "displacement_4.m", que gera um arquivo "vector8.txt" na pasta "vetores". Uma vez que o arquivo "vector8.txt" esteja aberto, haverá uma matriz de 8 x 4. Cada linha da matriz tem quatro números, que são as magnitudes do componente X, componente Y, componente Z e a magnitude SUM do vetor de deslocamento de um segmento específico do ventrículo.
NOTA: O vetor de deslocamento é obtido calculando o deslocamento do centroide em massa de cada segmento no espaço 3D. Calculamos
as coordenadas 3D de centroid de massa (PS e PD) (onde k indica a coordenada X, Y ou Z, respectivamente) de cada segmento (I-VI) no conjunto de dados de segmentação de systole a diastole ( Figura1J). Definimos o centroide em massa no espaço 3D da seguinte forma:
onde Cx = X, Cy = Y, e Cz = Z, Mi = a massa de cada segmento (I ≤ i ≤ VI), m = o número de voxels de cada segmento, e ρ = a função de densidade como a região segmentada é 1 enquanto o resto é 0. A norma L2 dos vetores de subdeslocamento ao longo dos eixos X-, Y e Z e o vetor de deslocamento de soma são calculados durante o ciclo cardíaco. Há um total de oito linhas na matriz. A primeira fila e a oitava fila contêm o canal arioventricular e, portanto, são ignoradas em nossa análise. Os segmentos I a VI são representados pela segunda fila para a sétima fila.
as coordenadas 3D de centroid de massa (PS e PD) (onde k indica a coordenada X, Y ou Z, respectivamente) de cada segmento (I-VI) no conjunto de dados de segmentação de systole a diastole ( Figura1J). Definimos o centroide 
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Representative Results
O processo pelo qual o DIAMOND foi desenvolvido para avaliar a função cardíaca segmental 3D é apresentado na Figura 1. Após a aquisição e reconstrução de imagens lSFM em 3D do coração de zebrafish embrionário (Figura 1A),o verdadeiro plano de eixo curto foi determinado como o plano perpendicular para os eixos longos verticais e horizontais, ambos determinados em um espectador multiplano (Figura 1B). O coração foi então reamostrado ao longo do plano de eixo curto (Figura 1C), e dividido em oito segmentos iguais constituídos por ângulos iguais de acordo com uma linha de divisão virtual (linha vermelha pontilhada) que conecta o centro da cavidade ventricular endocárdica ao centro do canal atrioventricular(Figura 1E). As representações 3D dos segmentos identificados são ilustradas em uma visão transversal (Figura 1F) e em comparação com os dados brutos (Figura 2). Os segmentos VII e VIII foram retirados da análise por englobarem o canal arioventricular e, assim, contêm menos miocárdio em comparação com outros segmentos. Os diferentes planos de reamostragem para systole final (HS)e diastole final (HD) levam a sistemas de coordenadas distintos para matrizes end-sistólicas e diastólicas finais, que precisam ser registradas para restaurar sua relação espacial original (Figura 1G). O sistema de coordenadas da matriz sistolica final foi escolhido como referência para consistência. Para determinar a matriz de transformação (Tm)da matriz diastólica final à matriz sistólica final, uma matriz de três paralelas, que é assimétrica em 3D e tem a mesma dimensão da matriz de imagem original, foi virtualmente criada. Os paralelos foram reamostrados duas vezes, primeiro no plano de eixo curto da matriz de systole final, e depois no plano de eixo curto da matriz de diastole final, levando a diferentes paralelos transformados para systole (verde) e fim-diastole (vermelho) (Figura 1H).
Os paralelos verde e vermelho foram então registrados juntos por um algoritmo rígido de registro do corpo e Tm foi calculado e aplicado à matriz de diastole final para restaurar as coordenadas (Figura 1I). Este processo permite o rastreamento subsequente no espaço 3D dos vetores de deslocamento de centrosides de massa de qualquer segmento do ventrículo durante o ciclo cardíaco (Figura 1J). O deslocamento de DIAMANTE dos segmentos ventriculares I-VI pode ser rastreado durante vários pontos de tempo no ciclo cardíaco (Figura 1K), que pode ser simplificado para análise quantitativa a dois pontos de tempo que vão de systole final a diastole final (Figura 1L). Os segmentos gerados pela DIAMOND podem ser visualizados na Figura 2,onde cada cor representa um segmento cardíaco.
Com o DIAMOND, descobrimos heterogeneidade segmental da função cardíaca e suscetibilidade à lesão miocárdica induzida por doxorubicina em zebrafish. Após um tratamento de 24 h com 10 μM doxorubicina de 3-4 dpf (Figura 3A), comparamos o deslocamento diamond de segmentos ventriculares entre os grupos de controle e quimioterapia(Figura 3B) e 48h após o tratamento (Figura 3C). Todas as figuras DIAMOND seguem o mesmo padrão gráfico que os ventrículos reamostrados ao longo do eixo curto (Figura 1E). Os dados são apresentados como percentuais ao normalizar a norma L2 do vetor de deslocamento para o perímetro interno do coração, com os componentes X (verde), Y (azul) e Z (laranja) ilustrados como suas contribuições ponderadas. Em 4 dpf, a média L2-norm dos vetores de deslocamento segmentais em peixes de controle variou de 6,6 a 11,3 μm, ou 3,8-6,6% após a normalização. Nossos resultados indicam que, condições de controle, os segmentos basal I e VI passam pelos maiores deslocamentos e são os mais suscetíveis à lesão cardíaca induzida por doxorubicina (Figura 3B, queda de 29% de 6,6-4,7%, n = 10 de controle e n = 8 doxorubicina, p < 0,01). Em 6 dpf, a média L2-norm dos vetores de deslocamento segmentais nos peixes de controle variou de 6,8 a 14 μm, ou 3,9-8% após a normalização. Com 6 dpf, os segmentos basal I e VI recuperaram o deslocamento DIAMOND para níveis de controle, sugerindo regeneração segmental (Figura 3C,n = 10 controle e n = 8 doxorubicina). Paralelamente, observou-se uma piora na cepa basal 2D de -53 para -38% a 4 dpf após o tratamento de doxorubicina, seguida de retorno aos níveis de controle em 6 dpf, corroborando os resultados de deslocamento diamond (Figura 3D, 3E). Também foi observada uma redução paralela na fração global de ejeção em resposta à doxorubicina a 4 dpf com recuperação de 6 dpf (Figura 3F, 3G).
Em seguida, aplicamos DIAMOND durante o tratamento de doxorubicina e modulação de caminho de entalhe usando o inibidor de entalhe DAPT e resgate usando os efeitos de notch a jusante NICD e NRG1 mRNA(Figura 4A). A microinjeção de NICD e NRG1 mRNA resgatou a diminuição do deslocamento de DIAMANTE e eF após lesão aguda induzida por quimioterapia em 4 dpf (Figura 4B, 4D). A exposição ao dapt inibidor de entalhe juntamente com a doxorubicina levou a uma diminuição mais difusa no deslocamento de DIAMANTE, além dos segmentos basal I e VI (Figura 4B). Além disso, a inibição da via Notch após a lesão induzida por quimioterapia dificultou ainda mais a recuperação do deslocamento diamond dos segmentos basais e EF em 6 dpf. A inibição foi resgatada pelos efeitos notch a jusante NICD e NRG1 (Figura 4C, 4E).
Figura 1: desenvolvimento de deslocamento DIAMOND 4D. (A) Imagens brutas foram capturadas por microscopia fluorescente de folha de luz. (B e C) O coração 3D reconstruído foi reamostrado ao longo da verdadeira visão do plano de eixo curto. (D) Ilustração esquemática do coração de zebrafish embrionário. (E e F) ilustrações 2D e 3D da divisão do ventrículo em oito segmentos excluindo os segmentos VII e VIII. (G) Os diferentes sistemas de coordenadas de end-systole e end-diastole após a reamostragem. (H) Um grupo de paralelas retangulares foi criado para a geração de uma matriz de transformação (Tm). (I) Sistemas de coordenadas end-sistólica e diatólica end-sistólicas registrados aplicando Tm. (J) Vetor de deslocamento da massa segmental centroid de end-systole para end-diastole. (K)Deslocamento DIAMOND de segmentos ventriculares I-VI rastreadodurante vários pontos de tempo no ciclo cardíaco. (L)Deslocamento DIAMOND de segmentos ventriculares I-VI de end-systole para end-diastole. Este número de Chen et al.8 é reproduzido com permissão da Sociedade Americana de Investigação Clínica (ASCI). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Segmentação diamond do coração de zebrafish embrionário em comparação com dados crus em 3D. O coração embrionário zebrafish foi dividido em seis segmentos (volumes) retratados aqui em cores diferentes para o cálculo dos deslocamentos de DIAMANTE (à esquerda). O vetor de deslocamento de cada segmento computado pela DIAMOND representa sua função cardíaca segmental. O átrio e o trato de saída foram removidos durante a segmentação. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: DIAMOND desvenda a heterogeneidade segmental na função cardíaca e suscetibilidade à lesão induzida pela quimioterapia. (A) Cronograma experimental do tratamento da doxorubicina. (B e C) Comparação segmental de vetores de deslocamento DIAMOND normalizados ao perímetro miocárdio interno entre os grupos tratados de controle e doxorubicina em 4 e 6 dpf (t testes, **p < 0,01, n = 8-10 por grupo). (D e E) Avaliação da tensão na base ventricular representando um padrão semelhante de lesão e regeneração como os vetores de deslocamento DIAMOND (*p < 0,05, n = 6-8 por grupo). (F e G) Diminuição na fração de ejeção em resposta à doxorubicina a 4 dpf com recuperação de 6 dpf, seguindo um padrão semelhante aos deslocamentos segmentais de DIAMANTE no nível ventricular global (testes t, **p < 0,01, barras de erro SEM, n = 6-10 por grupo). Este número de Chen et al.8 é reproduzido com permissão do ASCI. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Mecânica DIAMOND para avaliação da recuperação miocárdica mediada por entalhe após lesão induzida por doxorubicina. (A)Programação experimental. (B e C) Os agentes a jusante do NICD e nRG1 Notch resgataram a redução do deslocamento de DIAMANTE nos segmentos I e VI em 4 dpf. Com 6 dpf, a inibição da sinalização notch pelo DAPT prejudicou a restauração da função cardíaca segmental (ANOVA, **p < 0,01 Dox vs. controle; †p < 0,05,†p < 0,01, Dox + DAPT vs. controle, n = 6-10 por grupo). (D e E) A fração de ejeção corrobora a mecânica DIAMOND em nível global (ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, barras de erro SEM, n = 5-11 por grupo). Este número de Chen et al.8 é reproduzido com permissão do ASCI. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Uma estratégia rigorosa para quantificação da função miocárdio segmental é fundamental para avaliar a mecânica cardíaca além da EF tradicional, conhecida por ser um indicador insensível e atrasado de lesão miocárdica1,4,12. Assim, tem havido um crescente interesse em marcadores de mudanças miocárdicas precoces, e um corpo crescente de literatura apoia parâmetros de deformação do miocárdio como indicador inicial para prever disfunção ventricular4,13. A medição ecocardiográfica da cepa ventricular esquerda (LV) fornece um método estabelecido de medição de deformação do miocárdio13. No entanto, a imagem de cepa baseada em doppler tecidual sofre de uma série de deficiências devido à dependência do ângulo e à variabilidade intraobservador e interobservador14. A ecocardiografia de rastreamento de manchas de manchas (STE) pode resolver a deformação de tecido 2D independente e 3D independente do ângulo, mas a precisão do rastreamento de manchas 2D é afetada pelomovimento6 através do plano, enquanto o rastreamento de manchas 3D requer resolução espacial superior para resolver os padrões positivos de interferência de ultrassom (manchas) em 3D e alta resolução temporal para rastrear as manchas entre os quadros15. No presente protocolo, descrevemos o deslocamento DIAMOND como um novo parâmetro de deformação miocárdio para a quantificação in vivo da função cardíaca segmental 4D em zebrafish. Em comparação com a cepa EF e 2D como padrões de referência, a DIAMOND fornece informações adicionais de deformação segmentais sem ser afetada pelo movimento através do avião. Ao integrar o DIAMOND com o 4D LSFM, nossa técnica pode avaliar o vetor de deslocamento de um segmento cardíaco de 20 a 30 μm de largura, o que atualmente é impossível até mesmo para o sistema 3D STE mais avançado, que tem resolução de alcance milimétrico16.
Para aplicar o DIAMOND, é fundamental ter uma compreensão abrangente da estrutura anatômica do coração embrionário zebrafish. Durante a segmentação de imagem, é essencial que o canal arioventricular e o trato de saída sejam corretamente identificados e segmentados a partir do resto do miocárdio quando o usuário está realizando a etapa 6 no protocolo. Além disso, os eixos longos horizontais e verticais do ventrículo devem ser determinados com precisão para derivar o verdadeiro plano de eixo curto para reamostragem de imagem na etapa 8.
O principal fator limitante de taxa de aplicação do DIAMANTE é a segmentação manual do ventrículo, que se torna demorado quando várias fases durante o ciclo cardíaco podem precisar ser avaliadas. Com o avanço do aprendizado de máquina e redes neurais, um método automatizado de segmentação cardíaca17,18,19,20 poderia ser integrado com diamond para fornecer monitoramento da função cardíaca segmental durante todo o ciclo cardíaco. Outras aplicações da DIAMOND também incluem a integração com ecocardiografia, micro-CT ou microrressonância magnética, adequada em modelos animais maiores para a avaliação multiescala de lesões cardíacas e regeneração21. No entanto, o método exigirá primeiramente adaptação à presença de fibras miocárdicas que levam a uma deformação cardíaca mais complexa, incluindo a torção em mamíferos22,23.
No geral, a DIAMOND fornece um novo método para avaliar a função cardíaca segmental em zebrafish embrionários em condições fisiológicas e patológicas e pode ser usado como plataforma para triagem in vivo de vias associadas à triagem de vias associadas à triagem de vias associadas à triagem invivo de vias associadas à triagem invivo de caminhos associados à triagem invivo de vias associadas à triagem invivo de vias associadas à triagem invivo de vias associadas à triagem invivo de vias associadas à triagem invivo de vias associadas à triagem invivo de toxicidade cardíaca induzida pela quimioterapia.
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Disclosures
Os autores declararam que não existe conflito de interesses.
Acknowledgments
O presente trabalho foi financiado pelas bolsas 16SDG30910007 e 18CDA34110338, e pelos subsídios do National Institutes of Health HL083015, HL111437, HL118650 e HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
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