Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

Для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов, мы разработали подход к экрану массивных лентивирных или ретровирусных рнки библиотек с помощью двойной люциферазы основе транскрипционного репортера ассс. Такой подход предлагает быстрый и относительно недорогой способ проверки сотен кандидатов в одном эксперименте.

Abstract

Транскрипционные факторы могут изменить экспрессию многочисленных генов-мишеней, которые влияют на различные процессы вниз по течению, что делает их хорошими мишенями для противораковой терапии. Однако, непосредственно ориентации транскрипционных факторов часто трудно и может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, если транскрипционный фактор необходим в одной или нескольких взрослых тканей. Выявление восходящих регуляторов, которые аберантно активируют транскрипционные факторы в раковых клетках, предлагает более осуществимую альтернативу, особенно если эти белки легко смягчены. Здесь мы описываем протокол, который может быть использован для объединения массивных среднесрочных лентивирных библиотек и двухлюциферазы основе транскрипционного репортера асссы для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов в раковых клетках. Наш подход предлагает быстрый, простой и недорогой способ тестирования сотен генов в одном эксперименте. Чтобы продемонстрировать использование этого подхода, мы выполнили экран массивной лентивирусной библиотеки РНК, содержащей несколько регуляторов ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного со-активатора с pd'-связывающим мотивом (ТАЗ), двумя транскрипционными коактиваторами, которые являются эффекторами вниз по течению пути Гиппо. Однако этот подход можно было бы изменить для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции или со-фактора, а также можно было бы использовать для проверки библиотек CRISPR/CAS9, cDNA или ORF.

Introduction

Цель этого ассеса заключается в использовании вирусных библиотек для выявления регуляторов транскрипционных факторов относительно быстрым и недорогим способом. Аномальная транскрипционная активность связана с раком и метастазами1,,2,,3,,44,5,,6,поэтому таргетинг факторов транскрипции в раковых клетках является перспективным терапевтическим подходом. Тем не менее, транскрипционные факторы часто трудно ориентировать фармакологически7, и многие из них необходимы для нормальной клеточной функции во взрослых тканях88,9,,10. Ориентация на рак связанных путей, которые аберрантно активировать транскрипционные факторы для привода болезни является более осуществимым подходом с потенциалом иметь менее серьезные побочные эффекты. Коммерческая доступность массивных лентивирных и ретровирусных рнквирных РНК, CRISPR/CAS9, cDNA или ORF библиотек позволяет исследователям проверить важность многочисленных генов в одном эксперименте. Тем не менее, требуется надежное считывание для измененной транскрипционной активности.

Здесь мы описываем использование двойной люциферазы основе транскрипционного репортера анализ и массивные лентивирные библиотеки для выявления белков, которые регулируют транскрипционные факторы в раковых клетках. В этом исследовании, shRNAs, которые нацелены на рак связанных генов поставляются в клетки рака млекопитающих через лентивирусной трансдукции и клетки выбираются для стабильной интеграции с использованием пуромицина. Клетки следующий трансфицируется с репортером построить, что выражает светлячок luciferase управляется промоутер омрачается промоутер конкретных транскрипции фактор, который исследуется и контрольная конструкция, которая выражает Ренилья luciferase от constitutively активный промоутер, который не реагирует на транскрипции фактор исследуется. Мы демонстрируем этот подход с экраном доказательства концепции для регуляторов YAP и ТАЗ, критических эффекторов вниз по течению пути Гиппо8,10,11. Аномальная активность ЯП и ТАЗ способствует нескольким шагам метастатического каскада11 и наблюдается у многих видов рака11,,12,,13. Однако, как YAP и ТАЗ становятся аберантно активированы в некоторых раковых клетках еще не полностью понял. YAP и ТАЗ не связывают ДНК, но вместо этого набираются в промоутеров другими факторами транскрипции. Члены семейства факторов транскрипции TEA (TEAD) являются основными обязательными партнерами для YAP и ТАЗ, и имеют решающее значение для большинства функций, зависящих от YAP и ТАЗ. Наш репортер конструирует светлячок luciferase от YAP/ТАЗ-TEAD-реакционный промоутер и предыдущие изучения показали что оно верно обнаруживает изменения в YAP-TEAD и транскрипционной деятельности TA'-TEAD2,14,15.

Наш подход является быстрым, средней пропускной способностью и не требует скрининга, автоматизированных роботов или глубокого секвенирования объединенных библиотек. Затраты являются относительно низкими, и есть множество коммерчески доступных библиотек на выбор. Необходимое оборудование и реагенты также являются относительно стандартными в большинстве лабораторий. Он может быть использован для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции, если luciferase основе репортер существует или генерируется. Мы используем этот подход для скрининга shRNAs в раковых клетках, но любая клеточная линия, которая может быть трансфицирована с разумной эффективностью, может быть использована с любым типом массивной библиотеки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое резюме этого протокола показано на рисунке 1.

1. Подготовка лентивирусной векторной библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: На продемонстрированный экран использовался массивная библиотека shRNA, приобретенная в качестве глицерола в 96-колодцах, но библиотеки также могут быть собраны вручную на основе списка кандидатов. Соответствующие элементы управления должны быть рассмотрены и включены в любую библиотеку. Это включает в себя нетаргетинг контроля shRNA (shNTC), контроль shRNA ориентации транскрипции фактор расследуется, и, если возможно, шРНК ориентации светлячок luciferase.

  1. Добавьте 1,3 мл бульона Лурии (LB) (1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, pH 7.5), содержащий 100 мкг/мл ампициллина к каждой скважине 96-лугодовой скважины. Прививать каждый колодец с 2 л глицерола бульона и расти на 37 градусов по Цельсию в одночасье с постоянным волнением на 225 об/мин.
  2. Перенесите каждую бактериальную культуру в центрифугу мощностью 1,5 мл и гранулы бактерии центрифугированием при 21 000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
  3. Очистите каждый вектор с помощью бактериального мини-подготовительного комплекта, следуя протоколу производителя.
  4. Определите концентрацию каждого вектора с помощью спектрофотометра.
  5. Храните плазмиды при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

2. Упаковка массивной лентивирусной библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа, связанная с лецивирусом, включая упаковку, инфекцию и последующую культивирование инфицированных клеток, должна строго следовать институциональным правилам и положениям о биобезопасности.

  1. Расширить 293FT клетки с помощью полного роста средств (Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM), содержащий 4 мМ L-глютамин, 4500 мг/л глюкозы и пирувата натрия, дополненный 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мЛ стрептомицина антибиотики и 2 мМ L-глютамин).
  2. Для каждого вектора в библиотеке от шага 1.4, семена один 24-ну с 1 х 105 293FT клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы некоторые дополнительные скважины контрольного вирусного вектора были упакованы и использованы для проверки титра вируса до начала шага 3 (см. ниже).
  3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий протокол для упаковки лентивирус, который был описан ранее14 был сокращен до 24 скважин для этого протокола. Он использует psPAX2 для лентивирусной упаковки и VSVG в качестве белка пальто. Если пожелает экстропный вирус, вектор доставки Эко может быть использован вместо VSVG. Настоятельно рекомендуется, чтобы этот протокол был оптимизирован для достижения вирусного титра, который дает между 30%-70% эффективность инфекции целевых клеток (см. Обсуждение). Дополнительная таблица 1 для списка всех используемых векторов.
  4. Настроите трансфекционную смесь для каждого вирусного вектора из шага 1.4, как описано ниже. Каждый трансфекциондолжений должен содержать 250 нг вирусного вектора, 125 нг psPAX2, 125 нг VSVG, 1,25 л трансфекционного реагента 1, и 23,75 л буфера трансфекции (см. Таблица материалов).
    1. Разбавить каждый lentiviral вектор до 50 нг / Л с нуклеазой свободной воды, а затем передать 5 кЛ (250 нг) в колодец 96-хорошо ПЦР пластины.
    2. Сделать трансфекционный супер микс, смешивая 1,25 л х трансфекционного реагента 1 и 23,75 л X предварительно подогретого трансфекционного буфера, где "X" является общее количество трансфекций плюс несколько дополнительных для учета потери объема во время трубач.
    3. Инкубировать трансфекционную супермикст при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Добавьте 125 нг х psPAX2 и 125 нг Х VSVG в трубку трансфекционного супер микса от шага 2.4.3 и аккуратно пайпет вверх и вниз, чтобы смешать. Быстро перейдите к шагу 2.4.5.
    5. Немедленно aliquot смесь от шага 2.4.4 в каждую пробку прокладки PCR, и после этого используйте multi-channel пипетку для того чтобы перенести 25 qL смесь в каждую наилучшим образом содержа вирусный вектор от шага 2.4.1.
    6. Инкубировать при комнатной температуре 20 мин.
    7. Перенесите все 30 КЛ с каждого 96-хорошо от шага 2.4.6 в колодец из 24-ну, содержащей 293 клетки FT от Step 2.3.
  5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч, а затем заменить средства массовой информации в каждом колодце 24-хорошо пластины с 500 qL свежих средств полного роста. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 еще на 24 ч.
  6. Используя многоканальный пипетка, соберите вирусный супернатант из каждой скважины и aliquot 220 QL (достаточно для 1 инфекции в шаге 3 плюс дополнительный объем) в два 96-колодца каждый. Это массивные вирусные супернатантные пластины.
  7. Храните массивные вирусные супернатантные пластины при -80 градусах По Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Также рекомендуется протестировать некоторые из дополнительных вирусов контроля, который был упакован (см. выше) на клетках, чтобы быть инфицированы, прежде чем приступить к шагу 3. Это необходимо для того, чтобы титр был достаточен для достижения по крайней мере 30% эффективности инфекции.

3. Заражение клеток для экрана

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки меланомы человека (A375) были использованы, чтобы продемонстрировать этот подход, но этот метод может быть применен к любым клеткам приверженцев, которые заражают лентивирусом. Тем не менее, клеточная культура и условия покрытия должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии (см. Обсуждение).

  1. Расширьте клетки для заражения в носителях полного роста.
  2. Семена 24-ну с тарелками с 1 х 105 клетками в 0,5 мл полного роста носителя в скважине. Семена один хорошо для каждого вирусного вектора, которые будут проверены (в том числе контроля) и включают в себя дополнительные хорошо, что не будет инфицирован, который будет служить в качестве контроля для выбора наркотиков в шаге 3.7.
  3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.
  4. Заразить каждый колодец от шага 3.2 с различными вирусных супернатант из замороженных массивных lentiviral супернатант следующим образом.
    1. Подготовьте полный рост носителя, который содержит 20 мкг/мл полибрена.
    2. Оттепель массивных лентивирусной библиотеки supernatants от шага 2.7 до комнатной температуры.
    3. Аспирировать рост средств массовой информации из 24-коловидной пластины от шага 3.2 и сразу же добавить 200 зл полибреносодержащих средств роста к каждой скважине.
    4. Используя многоканальный пипетку, перенесите 200 qL вирусного супернатанта с каждого 96-хорошо с шага 3.4.2 на 24 скважины от шага 3.4.3.
  5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 - 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клеточные линии могут потребовать сят более 24 ч, чтобы выразить шРНК и стать пуромицин устойчивостью. Вирусный вектор, используемый здесь, обеспечивает Turbo-GFP-IRES-puroR с miR30 основе shRNA в 3'UTR puroR (Рисунок 1). Эффективность инфекции и экспрессия гена устойчивости пуромицин и shRNA были проверены зеленым флуоресцентным белком.
  6. Подготовьте полный рост носителя, который содержит 2,5 мкг/мл пуромицин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация отбора пуромицина варьируется между клеточными линиями. Рекомендуется, чтобы кривая убийства антибиотика была выполнена для каждой линии клеток, чтобы быть проверены до экрана.
  7. Аспирируйте средства массовой информации из каждой скважины и заменить 500 л пуромицин-содержащих полный рост средств массовой информации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте также добавить пуромицин в контроль неинфицированных хорошо, которые могут быть использованы в последующих шагах для обеспечения выбора пуромицин завершена.
  8. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего выбрать для 48 ч, так что плотность покрытия и вирусный титр должны быть оптимизированы таким образом, чтобы клетки не пересохли до 48 ч.
  9. Убедитесь, что инфицированные клетки зеленые под флуоресцентным микроскопом, и что клетки на контроле неинфицированных хорошо обработаны пуромицин все мертвы, прежде чем приступить к Шаг 4.

4. Посевные клетки для трансфекции двойного люциферазы репортер

ПРИМЕЧАНИЕ: Тест трансфекции должно быть сделано, чтобы определить оптимальную плотность посева для каждой новой линии клеток.

  1. Трипсинизуить каждый колодец от шага 3.9 и передать примерно 1 х 105 клеток в скважины в соответствующем положении на новой 24-хорошо пластины следующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для скрининга библиотек с сотнями shRNAs, так что это не представляется возможным подсчитать каждый колодец инфицированных клеток. Таким образом, приведенные ниже шаги использовались для оценки числа ячеек в каждой скважине, чтобы обеспечить примерно равную плотность покрытия.
    1. Группируйте скважины от шага 3.9 до 3 - 4 групп так, что все скважины в группе имеют сходную плотность клеток.
    2. Трипсинизировать 1 представитель хорошо от каждой группы с 200 зл и л трипсин-EDTA (1x PBS дополнены 0,5 мМ EDTA и 0,1% трипсин) в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию. Затем нейтрализуйте трипсин-ЭДТА, добавив 400 л пуромицина, содержащего полный рост носителей.
    3. Считайте каждого представителя хорошо, чтобы определить общее число клеток и разбавить подвеску ячейки от каждого представителя хорошо 2 х 105 ячеек / мл с помощью полного роста средств массовой информации.
    4. Семена 0,5 мл (1 х 105 клеток) каждого колодца от шага 4.1.3 в соответствующее положение на новой 24-хорошей пластине и инкубировать эту новую 24-колодную пластину при 37 кв с 5% CO2 на 24 ч.
    5. Для каждой группы из шага 4.1.1 используйте общее число клеток, определенное в шаге 4.1.3, чтобы вычислить объем трипсина-EDTA, чтобы добавить к каждой скважине, так что результирующая суспензия ячейки будет 1 х 106 ячеек/мл.
    6. Добавьте соответствующий объем трипсина-ЭДТА к каждой скважине и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для большего экрана рекомендуется, чтобы 24-колодские пластины были промыты и перенапарты в группах, а не все сразу, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток.
    7. Во время вышеуказанной инкубации используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 400 qL пуромицинсодержащих полных носителей роста к соответствующим скважинам на новой 24-хорошей пластине.
    8. Передача 100 злиц клеточной подвески (примерно 1 х 105 ячеек) из каждой скважины в соответствующее положение на новых 24-колодцах, подготовленных в шаге 4.1.7.
    9. Повторите шаги 4.1.6 до 4.1.8 для всех плит сгруппированных колодцев от Шага 4.1.1, по одной пластине за раз.
  2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.

5. Трансфекция двойного люциферазы репортер

  1. Transfect каждый из шага 4.2 с двойной люциферазы репортер строит следующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество ДНК и оптимальное соотношение светлячковии репортер вектор для контроля Ренилья люциферазы вектор должен быть определен до начала этого анализа. Здесь, 400 нг ДНК смеси, которая содержит 20 частей светлячок luciferase репортер и 1 часть управления Ренилья luciferase был использован.
    1. Сделать трансфекционно-разбавленную смесь (Труба А) и смесь разбавления репортера (Труба B) путем смешивания указанных объемов каждого реагента (Таблица 1) умножается на общее количество трансфекций (плюс несколько дополнительных).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для трансфекционного реагента 2 (см. Таблицу Материалов). Если используется другой трансфекционный реагент, трансфекция должна быть оптимизирована до этого шага.
    2. Смешайте смесь трансфекционного разбавления (Tube A) со смесью разбавления репортера (Труба B) и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут для производства трансфекционной смеси.
    3. Во время вышеуказанной инкубации, промыть каждый 24-хорошо от шага 4.2 с 0.25 мл фосфатного буфера соления (PBS), и добавить 447 л полных носителей роста к каждой скважине.
    4. После инкубации в 15 минут используйте многоканальный пипетки для распределения 53 кЛ трансфекционной смеси для каждой скважины из 24-колодцев.
  2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.

6. Количественная оценка активности двойной люциферазы

  1. Измерьте активность luciferase с помощью считывателя пластин и двойного люциферазы репортер ассес комплект, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для указанного набора репортира (см. Таблица материалов)и соответствует рекомендуемому протоколу производителя.
    1. Подготовьте достаточное количество буфера 1x пассивного лизиса для всех скважин плюс несколько дополнительных (75 л необходимо в скважине) путем разбавления 5x пассивный буфер лизиса (при условии в комплекте) от 1 до 5 с деионизированной водой. Также оттепель реагента А и реагента B Buffer (при условии, в комплекте, 100 л каждого необходимо для каждой скважины).
    2. Аспирируй средства массовой информации от каждой скважины из 24-хорошо пластины от шага 5.2.
    3. Добавьте 75 кВ 1x пассивный буфер лисиса к каждой скважине и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут с иногда встряхивания.
    4. Подготовка реагента B путем разбавления 50x реагент B субстрата (при условии, в комплекте) 1:50 с оттаять реагентом B буфера.
    5. Добавьте 30 qL 1x пассивного лисиса буфера на 4 скважины для зачистки (см. Дополнительную таблицу 2).
    6. Передача 30 л lysate от шага 6.1.3 в дубликат скважины 96-хорошо плоский нижний белый асссе пластины.
    7. Используйте многоканальный пипетка, чтобы добавить 50 зл реагента К каждому хорошо и читать светлячок luciferase сигнал с плитой читателя.
    8. Используйте многоканальный пипетка, чтобы добавить 50 qL реагента B от шага 6.1.4 к каждому хорошо и читать сигнал Renilla luciferase с считывателей пластин.
  2. Обработка исходных данных следующим образом (для подробного описания см. Дополнительную таблицу 2).
    1. Исключить образцы с очень низким сигналом Luciferase Ренилья как низкие значения указывают на то, что вирусная конструкция была токсичной или что слишком мало трансинфицированных клеток были анализированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как поясняется в обсуждении, значительно "низкий" сигнал Ренилья люциферазы может привести к аномальным результатам. Здесь были исключены скважины, в которых сигнал Рениллы люциферазы был более чем на 1 стандартное отклонение ниже среднего (см. Дополнительную таблицу 2). Это было основано на предыдущих исследованиях, проведенных с помощью этой системы репортера в этих клетках14, но может отличаться в других клеточных линиях.
    2. Нормализация сырья светлячок luciferase значение каждого колодца в сырье Ренилья luciferase значение же хорошо, чтобы получить светлячок /Ренилья соотношение.
    3. Средний светлячок /Ренилья отношения всех репликации контрольных скважин, а затем разделить светлячок /Ренилья соотношение любой другой хорошо, что число, чтобы получить раз изменения.
    4. Назначайте контрольный образец и установите его значение соотношениясветлячков/Рениллы к 1.
    5. Среднее соотношениесветлячков/Ренильи дублирующих скважин и участка со стандартным отклонением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное отклонение не используется для статистического анализа, а вместо этого в качестве средства для выявления скважин, где репликации значительно отличаются.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наша конструкция репортера YAP/TA'-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,,15) содержит минимальный промоутер SV-49 с 5 повторами канонического связывающего элемента TEAD (MCAT)15 за рулем гена светлячком luciferase(рисунок 1). Он совместно трансфицируется в клетки вместе с PRL-TK контрольный вектор (Промега), который выражает Ренилья люциферазы от constitutively активный hSV ТЗ промоутер (Рисунок 1). Очень важно обеспечить, чтобы конструкция репортера YAP/TA'-TEAD вела себя так, как ожидалось в проверяемых линиях ячейки. Таким образом, мы сначала совместно трансфицировали PRL-TK и pGL3-5xMCAT (SV)-49, конструируя в клетки A375, четко выражающие либо вектор управления, высокоактивный нечувствительный мутант LATS YAP (YAP2SA),или мутант YAP2SA, неспособный связать TEAD (YAP2SA, S94A). Как и ожидалось, светлячок люциферазы активность была значительно увеличена yAP2SA, но не контрольный вектор или YAP2SA,S94A (Рисунок 2A). Это говорит о том, что YAP повышает активность репортера YAP/TA'-TEAD в зависимости от TEAD. Важно отметить, что YAP2SA не существенно изменил уровень люциферазы Рениллы. В качестве дополнительного контроля, мы также подтвердили, что YAP2SA не изменяет деятельность минимальной конструкции промоутера, которая не имеет связывающих элементов MCAT TEAD (Рисунок 2B).

Был также проведен второй контрольный эксперимент, в ходе которого клетки A375 были заражены вирусными конструкциями, которые обеспечивают либо нецелевую контрольную шРНК (shNTC), либо конструкцию с тандемом YAP и TA' shRNA. После стабильного отбора, клетки были совместно трансфицированы с PRL-TK конструкции и либо YAP / TA'-TEAD репортер построить или минимальный промоутер построить. В клетках, трансфицированных с YAP / ТАЗ-TEAD репортер астративные конструкции, YAP / ТАЗ shRNA значительно снизили уровень светлячка luciferase, но контроль shNTC не(Рисунок 2C). Уровни светлячковии не были изменены ни shNTC, ни YAP/TA'shRNA в клетках, трансфицируемых с минимальным промоутером(рисунок 2C). В соответствии с результатами выше, сигнал Ренилла в каждой скважине также не был существенно изменен контрольsh или YAP / ТАЗ shRNA (Рисунок 2C), далее указывая, что PRL-TK конструкции управления не реагирует на YAP или ТАЗ. В совокупности эти эксперименты показывают, что система репортеров ведет себя так, как ожидалось в клетках A375, что согласуется с предыдущими исследованиями с использованием этих векторов2,,14.

В качестве доказательства концептуального эксперимента мы проверили небольшую библиотеку лентивирусной шРНК в клетках A375. Наша тестовая библиотека содержала shRNA, ориентированные на несколько генов, которые ранее были показаны для регулирования функции YAP/TA' в других типах клеток. Однако роль нескольких из этих генов в регуляции ЯП и ТАЗ в меланоме неизвестна. Наша библиотека включала гены, необходимые для деятельности YAP/TA, такие как RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, E-S2, PDK1, ERBB4, и CCNE216,,17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27,,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,,37,,38, и гены, предсказанные для ингибирования активности YAP / ТАЗ, такие как CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Гельсолин (GSN), PTEN, ATR, и RB139,40,,41,42,4343,44, 45,46,,47,,48,,49,,50,,51,,52,,53,,54. В качестве контроля, мы включили тандем YAP / ТАЗ shRNA14, нетаргетинг контроля shRNA (shNTC), и shRNA ориентации Src, который мы ранее показали, было необходимо для максимальной деятельности YAP / ТАЗ в A375 клеток14.

Необработанные данные и анализ для этого экрана отображается в дополнительной таблице 2. Несколько shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 и shMAPK8-2) значительно уменьшили сигнал рениллы luciferase относительно среднего сигнала Рениллы для всех скважин, предполагая, что эти шРНК вызывают цитотоксичность в клетках A375. Действительно, эти скважины имели значительно меньше клеток во время асссе (не показано). Это делает его очень трудно отличить кандидатов, которые могут регулировать YAP / ТАЗ от тех, которые необходимы для выживания клеток. Таким образом, результаты этих выборок исключаются из дальнейшего анализа данных. Как и ожидалось, shRNAs ориентации YAP и ТАЗ или Src значительно сократили активность YAP / ТАЗ-TEAD (рисунок 3). В соответствии с опубликованной работой, показывающей, что PIK3CA способствует YAP и ТАЗ деятельности21,26,31, мы обнаружили, что shRNAs ориентации PIK3CA снижение нормализованных уровней светлячка люциферазы. shRNAs ориентации ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN каждый увеличил нормализованные уровни светлячков, что согласуется с опубликованными исследованиями, показывающими, что эти белки подавляют YAP и / или ТАЗ39,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . Несмотря на установленные роли для ATR, CCNE2 и ERBB4 в других типах клеток27,,28,,35,,36,,38,,49, shRNAs ориентации этих генов не существенно изменить нормализованные уровни светлячков светлячка в клетках A375. shRNAs ориентации E'H2 и RB1 показал влияние на светлячковых уровнях люциферазы, что было противоположно тому, что ожидалось на основе исследований в других типах клеток32,34,40,52. Как PTEN, так и RAF1 были направлены на две различные shRNA, которые имели противоположное влияние на активность люциферазы. Результаты, несовместимые с предыдущими исследованиями, могут указывать на то, что влияние этих белков на функцию YAP/TA'-TEAD зависит от типа клеток; однако, это также может быть связано с плохой эффективностью нокдауна или вне целевых эффектов некоторых shRNAs. В качестве "слепого" экрана n n 1 можно было бы ожидать некоторых ложных срабатываний и ложных негативов. Как более подробно обсуждалось в обсуждении, дополнительные эксперименты проверки должны быть сделаны с использованием других assays, таких как qPCR для генов, которые регулируются YAP и ТАЗ и западных помарки для пост-переводных изменений, которые влияют на функцию YAP /TA. Эта проверка будет также включать в себя подтверждение того, какие shRNAs эффективно сбил белка интерес. Важно также отметить, что, поскольку наш репортер TEAD реагировать, любые гены, выявленные нашим экраном может влиять на TEADs, но не YAP и ТАЗ непосредственно. Последующим механистическим исследованиям потребуется определить, является ли это YAP и / или ТАЗ или TEADs, что выявленный белок регулируется. Тем не менее, YAP и ТАЗ являются основными драйверами тэц-опосредованной транскрипции, так что вполне вероятно, что большинство из этих генов регулируют YAP и ТАЗ. Действительно, как указано выше, большинство shRNAs, которые попали в экран целевых белков, которые, как известно, регулируют YAP и / или ТАЗ непосредственно.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая диаграмма рабочего процесса. Критические шаги этого протокола суммируются с числами шагов, соответствующими числам в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Оптимизация системы транскрипционной транскрипции YAP/TA'-TEAD.TEAD. ()A) A375 ячейки устойчиво выражая контрольный вектор (MSCV-IRES-Hygro), LATS-нечувствительный YAP (YAP2SA),или LATS-нечувствительный YAP не в состоянии связать TEADs (YAP2SA,S9 4A) были совместно трансфицированы с PRL-TK(Renilla) и pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/TA'-TEAD репортер) конструкций и luciferase сигнал был измерен 24 часов спустя. n 7 независимых экспериментов. (B) A375 клетки были совместно трансфицируются либо YAP2SA или контрольный вектор, PRL-TK построить, и либо pGL3-5xMCAT (SV)-49 построить или pGL3 (SV)-49 построить (минимальный промоутер) и люциферазы сигнал был измерен 24 часов спустя. n 1 эксперимент, трансфицируемый в четвероногих. (C) A375 клетки были инфицированы ретровирусом, кодирующим нетаргетационную контрольную шРНК (SHNTC) или тандем YAP и TA' shRNAs (shYAP/TA). После стабильного отбора, клетки были совместно трансфицируются с PRL-TK конструкции и либо pGL3-5xMCAT (SV)-49 конструкции или pGL3 (SV)-49 конструкции и люциферазы сигнал был измерен 24 часов спустя. n - 4 независимых инфекции; Статистическая значимость была определена с помощью односторонней ANOVA, за которой последовал тест на несколько сравнений Туки; n.s. - стр.г.н.; 0,05, п.т.;0,05, злит;0,01, пюlt;0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Результаты репрезентативного экрана. Результат от каждого сбить вектор сравнивается с shNTC и представлен как разразница. График бара показывает среднее соотношение светлячков люциферазы/Рениллы люциферазы - стандартное отклонение. n 1 эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Труба A - Трансфекция Разбавления
Реагента Объем
Трансфекционный буфер 25 л на реакцию
Трансфекционный реагент 2 (добавить второй) 1,5 л на реакцию
Труба B - Репортер Разбавления
Реагента Объем
Трансфекционный буфер 25 л на реакцию
20:1 Светлячок luciferase репортер: контроль Ренилья смесь (добавить второй) 400 нг за реакцию
Трансфекционный реагент 3 (добавить третий) 1 юл на реакцию
Итого: 26,5 л на реакцию

Таблица 1: Подготовка трансфекционной смеси. Для трансфекции в каждой скважине 24-колодца пластин, 1,5 л трансфекционного реагента 2 разбавляется в 25 л трансфекционного буфера для получения трансфекционного разбавления (трубки А); в то время как 400 нг 20:1 светлячок luciferase репортер: контроль Ренилья смесь и 1 Зл трансфекционного реагента 3 разбавлен в 25 Л трансфекционного буфера для производства репортер разбавления (трубка B).

Существующие/приобретенные/подарочные векторы
Вектор Источник
ГИПЗ человеческие шРНК лентивирные векторы GE Здравоохранение
VSVG Хайнс Лаборатория
psPAX2 Аддген (#12260)
кляп/поль Аддген (#14887)
pGL3-(SV)-49 Иэн Фарранс (15)
pGL3-5xMCAT (SV)-49 Иэн Фарранс (15)
PRL-TK Промега
MSCV-IRES-Hygro ЛАМАР ЛАБОРАТОРИЯ
MSCV-YAP-S127A, S381A-IRES-Hygro ЛАМАР ЛАБОРАТОРИЯ
MSCV-ЗСГрин-2A-Puro-hYAP7/hTA3 ЛАМАР ЛАБОРАТОРИЯ (ЛАМАР)
Новые векторы
Вектор Источник позвоночника
MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro MSCV-IRES-Hygro

Дополнительная таблица 1: Таблица векторов. Все используемые векторы перечислены с новыми вектором. Для создания новых векторов использовались стандартные методы молекулярной биологии.

Дополнительная таблица 2: Анализ данных Luciferase анализировать. Расположение библиотеки shRNA отображается в первом столе. На второй и третьей таблицах показаны необработанные сигналы светлячка и luciferase Renilla соответственно. Среднее и стандартное отклонение сигнала ренилья люциферазы для всех скважин указывается в желтых коробках. Скважины с сигналом Luciferase Рениллы более чем на 1 стандартное отклонение ниже среднего выделены красным текстом и исключены из дальнейшего анализа. Соотношениесветлячков/Ренильи каждого колодца было получено путем деления необработанного сигнала светлячка люциферазы по необработанному сигналу Рениллы люциферазы (четвертая таблица). Соотношениесветлячков/Ренилья каждой скважины затем нормализовалось до среднего соотношения светлячков/Ренильи контрольных скважин (shNTC) (пятая таблица).Renilla Затем дублируются скважины для каждой конструкции, и было рассчитано стандартное отклонение (шестая таблица). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании мы демонстрируем подход к скринингу средней пропускной связи массивных вирусных библиотек в сочетании с анализом транскрипционного репортера на основе двойной люциферазы, который может быть использован для выявления и тестирования новых регуляторов транскрипционных факторов. Очень важно охарактеризовать и оптимизировать систему репортеров для каждой ячейки перед любым экраном. Эксперименты должны проводиться для подтверждения того, что репортер реагирует на измененную активность исследуемого транскрипционного фактора и что масштабы изменений в деятельности должны быть проверены по отношению к контрольным векторам. Совместное трансфекцию конструкции PRL-TK вместе с конструкцией репортера важно, потому что это помогает контролировать количество клеток, трансфицируемых репортером, и номер копии конструкции репортера, оба из которых могут изменить величину сигнала люциферазы. Эксперименты по оптимизации должны также гарантировать, что фактор транскрипции не влияет на активность составной конструкции Renilla или минимальной конструкции промоутера, поскольку это может осложнить интерпретацию результатов. Необходимо также тщательно рассмотреть вопрос о контроле, который должен быть включен в библиотеку. Этот протокол предназначен для "слепого экрана" библиотек с сотнями shRNAs, где это не представляется возможным для подтверждения эффективного нокдауна каждой shRNA. Таким образом, некоторые ложные срабатывания и негативы, скорее всего. Увеличение числа технических и/или биологических репликатов на экране может помочь уменьшить количество ложных срабатываний и негативов. Тем не менее, это также значительно увеличит количество колодцев для культуры и проверки так следует позаботиться о том, чтобы это не привело к неоптимальным условиям культуры (см. ниже). Другой подход к уменьшению ложных срабатываний и негативов заключается в том, чтобы повторить весь экран в той же линии клеток или дополнительных клеточных линий, или для проверки меньшей библиотеки, включая только "хиты" с помощью 3 биологических репликатов. Во всех случаях, любые хиты должны быть проверены с помощью считываний, кроме репортера, таких как qPCR для известных генов-мишеней. Эффективный нокдаун целевого гена также должен быть подтвержден в этих шагах проверки. Выводы не должны быть сделаны о shRNAs, которые не меняют деятельность, если эффективный нокдаун shRNA не подтверждается. Эксперименты по проверке должны также гарантировать, что исследуемый транскрипционный фактор регулируется целевым геном (ы) и что эти гены не влияют на рениллу или минимальные конструкции промотора.

Важно также оптимизировать условия культуры клеток для каждой клеточной линии, чтобы избежать неоптимальных условий, таких как чрезмерное слияние, слишком мало клеток, плохая жизнеспособность клеток, или переменная пролиферативная емкость. Плотность посева клеток особенно важна во время трансфекции конструкции репортера с двойным люциферазой (Шаг 5) и при измерении активности репортера (Шаг 6). Эффективность трансфекции может значительно варьироваться с плотностью клеток и плохой эффективностью трансфекции может привести к аномальным результатам, если только небольшая часть популяции клеток в настоящее время асссес. Большинство проверенных клеточных линий показывают самую высокую эффективность трансфекции при слиянии 40 - 60%, но рекомендуется оптимизировать условия трансфекции и плотность посева для данной клеточной линии с помощью вектора, который обеспечивает флуоресцентный белок. Сотовые линии, которые трудно заразить и/или трансфект, такие как первичные клетки, могут быть не пригодны для этого экрана. Плохая эффективность трансфекции репортера или плохая жизнеспособность клеток обычно приводят к очень низкому сигналу luciferase Ренилья. Тем не менее, экспериментальный эксперимент должен быть выполнен, чтобы определить диапазон сигнала luciferase Ренилья для клеточной линии. Важно, чтобы титр вируса, производимого из массивной библиотеки достаточно высока, чтобы дать инфекции эффективность, по крайней мере 30% в клеточной линии проходит расследование. Эффективность инфекции может сильно варьироваться и несколько факторов могут влиять на вирусный титр. Количество вирусных супернатант используется должны быть оптимизированы для каждой линии клеток и в случае необходимости, Шаг 2 может быть оптимизирован атакжемрет для улучшения вирусных титр.

Плотность клеток и жизнеспособность клеток могут также влиять на активность клеточных путей, которые регулируют транскрипционные факторы, поэтому очень важно, чтобы семена клеток для репортера трансфекции, так что все они находятся на аналогичной плотности в день двойного люциферазы анализ читается (Шаг 6). Важно также обеспечить, чтобы клетки придерживались равномерно через скважину, а не кластеризации в плотном участке в центре. Как описано выше, значительные изменения в сигнале luciferase Ренилья от колодца к колодцу могут привести к данным, которые трудно интерпретировать. Лучше всего исключить скважины, которые показывают значительное снижение сигнала luciferase Ренилья по сравнению со всеми другими скважинами, поскольку это говорит о том, что либо вирусный вектор снижает жизнеспособность клеток или эффективность трансфекции для этого колодца была очень низкой. Здесь мы исключили скважины больше 1 стандартного отклонения от среднего сигнала luciferase Ренилья, но оптимизация эксперименты должны быть сделаны, чтобы определить соответствующие отсечения для каждой линии клеток. Также возможно, что шРНК, которые снижают жизнеспособность клеток, могут делать это, изменяя активность прошивки фактора, который подвергается асссированию. Если это вызывает озабоченность, shRNAs, которые уменьшают ренилья люциферазы сигнал может быть повторно протестирован с помощью индуцируемых shRNAs или других анализов. Также важно ограничить количество времени, в течение которого клетки адептов находятся в подвеске после трипсиизации. Используйте многоканальный пипетку для большинства шагов во время трипсинизации и посева ячеек, а для больших экранов работайте с пластинами партиями. Кроме того, лучше всего ограничить время между инфекцией клеток и журналистом. Это особенно важно, если проверяемый транскрипционный фактор регулирует пролиферацию клеток или выживание. В этом случае, клетки с эффективным нокдауном будут outcompeted клетки с менее эффективным нокдаун.

Возможны некоторые изменения в описанном протоколе. Этот подход может быть эффективно использован для выявления регуляторов любого фактора транскрипции, если формируется репортер на основе люциферазы, и для многих из наиболее распространенных факторов транскрипции репортер конструкций уже существуют. Этот протокол может быть изменен для использования широкого спектра коммерчески доступных или вручную собранных библиотек, включая RNAi, CRISPR/CAS9, ORF или cDNA. Действительно, мы ранее использовали аналогичную стратегию для тестирования небольшой библиотеки кДНК для регуляторов YAP/TA '14. Библиотеки могут быть доставлены с помощью ретровируса, лентивирус, аденовирус, или переходных переходных. Вирусный белок пальто, используемый здесь (VSVG) генерирует лентивирус, который является человеком-инфекционной. Если используются клетки грызунов и желательно нечеловеческий инфекционный экотропный вирус, то вместо VSVG можно использовать вектор, доставляющий белок Eco coat.

Другие методы могут быть использованы для проверки библиотек для регуляторов транскрипции фактора. Доступ к высокопроизводительному скрининговому центру позволит осуществлять автоматизированный отбор гораздо более крупных библиотек. Аналогичным образом, экраны по всему геному могут быть сделаны с использованием объединенных библиотек с глубоким секвенированием в качестве средства для выявления "хитов". Однако оба этих подхода требуют оборудования, которое недоступно для многих исследователей, и плата за скрининг высокой пропускной способности или глубокое секвенирование может быть непомерно высокой. Кроме того, объединенные экраны потребуют сортировки клеток с помощью флуоресцентного репортера или другого способа обогатить клетки, которые показывают желаемые изменения в транскрипционной активности. Скрининг больших массивных библиотек выражения с использованием двойной люциферазы основе транскрипционного репортера анализ был продемонстрирован ранее с помощью скамейкиробота 55, но это не обычно доступны для всех исследователей. В отличие от этого, описанный здесь метод является быстрым, средней пропускной результат, относительно недорогим, и использует оборудование и реагенты, которые, вероятно, доступны для большинства исследователей. Этот метод может выявить несколько регуляторов в одном эксперименте, который является экономически эффективным и удобным способом обнаружения потенциальных путей регулирования вверх по течению транскрипции фактора.

В описанном подходе гены кандидатов были стерли с ног, а затем после отбора конструкции репортера были преходяще трансфицированы в клетки. Тем не менее, эффективность трансфекции является плохой во многих клеточных линиях и может ввести изменчивость и вызвать клеточной токсичности. Улучшенный альтернативный подход заключался бы в том, чтобы заглушить конструкцию репортера в геном интересующей сяральной линии, а затем заразить клетки, выражающие репортера, вирусными библиотеками для скрининга. Это улучшение позволит уменьшить изменчивость, вызванную переходным переходным путем, и предотвратит любые потенциальные изменения в активности транскрипционного фактора из-за длительной постинфекционной культуры. Как уже упоминалось выше, использование небольшой скамейке робота значительно упорядочить процесс и увеличить размер библиотек, которые могут быть проверены. Другим значительным изменением является использование массивных индуцированных переносчиков, что снизит вероятность отбора в отношении ячеек с более эффективным нокдауном и уменьшит изменчивость, вызванную изменениями жизнеспособности клеток.

Значительная проблема, которая предотвращает эффективное лечение многих видов рака является то, что опухолевые клетки приобретают устойчивость даже к наиболее эффективным целевых методов лечения. Идентификация белков, необходимых для этой терапевтической резистентности, необходима для улучшения исхода пациента. Описанный подход может быть легко использован в сочетании с целевыми терапевтическими препаратами для выявления генов, которые вызывают повышенную чувствительность или устойчивость к этим соединениям. Другим потенциальным будущим применением этого подхода было бы использование этого массивного скрининга для проверки терапевтических целей кандидатов в сочетании. Для этого клетки будут инфицированы двумя вирусными вектором каждый с целью выявления белков, которые имеют синергетический эффект на активность транскрипции фактора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Эмили Нортон и Микаэлан Куччарре-Стулигсу за помощь в подготовке векторов шРНК. Эта работа была частично поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присуждается JML (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Tags

Исследования рака Выпуск 157 транскрипционный фактор массивный экран РНК YAP ТАЗ TEAD двойной люциферазы репортер транскрипционный репортер ассс рак
Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, Y., Lamar, J. M.… More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter