초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색
Summary
여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.
Abstract
지질은 동물 발달과 생리적 항상성에 필수적입니다. 지질 대사의 dysregulation는 각종 발달 결함 및 질병, 비만 및 지방 간 과 같은 귀착됩니다. 일반적으로 지질은 세포의 다기능 지질 저장 소기관인 지질 방울에 저장됩니다. 지질 방울 크기와 다른 조직에서 다른 조건에서 수 다양. 지질 방울은 그것의 생발생 및 저하의 규제를 통해 단단히 통제 되는 보고 되었습니다. Drosophila melanogaster에서,oenocyte는 지질 물질 대사를 위한 중요한 조직이고 최근 스트레스에 응하여 지질 동원에 관하여 인간 간 유사체로 확인되었습니다. 그러나, oenocytes에 있는 지질 물방울 물질 대사의 규칙의 밑에 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 지질 방울 동적 변화를 직접 시각화하는 신뢰할 수 있고 민감한 방법을 개발하는 것이 가장 중요합니다. 여기에 설명된 지질 방울 특이적 형광 염료인 친유성 BODIPY 493/503을 활용하면 기아에 대한 반응으로 드로소필라 유충의 선혈구에서 해부 및 후속 지질 방울 염색에 대한 상세한 프로토콜이 설명되어 있다. 이것은 공초점 현미경 검사법에 의하여 각종 조건 의 밑에 지질 작은 물방울 역학의 질적인 분석을 허용합니다. 또한, 이 신속 하 고 높은 재현 가능한 방법은 또한 oenocytes 및 다른 조직에 지질 방울 대사를 포함 하는 새로운 유전 요인을 식별 하기 위한 유전 화면에서 사용할 수 있습니다.
Introduction
지질은 세포 생존에 필수적입니다. 세포막 시스템의 필수 구성 요소로서의 전통적인 역할 외에도 지질은 또한 개별 동물의 수명 주기 전반에 걸쳐 에너지 공급 및 신호 변환에 중요한 기능을 합니다1. 따라서 지질 대사는 세포에서 생리적 지혈을 유지하기 위해 엄격한 규정을 준수해야합니다. 지질 대사의 조절은 당뇨병이나 지방간 과 같은 다양한 질병을 초래하는 것으로 알려져 있다. 동물 건강에 지질 대사의 큰 중요성에도 불구 하 고, 지질 물질 대사 규칙 기본 메커니즘 크게 알 수 없는 남아.
초파리는 토마스 H. 모건 교수가 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문을 포함하는 연구에서 그들을 사용하기 시작한 이후 년 동안 광범위하게 사용되어왔다2. 지난 수십 년 동안, 새로운 증거는 Drosophila가 비만1,3과같은 많은 지질 물질 대사 관련 질병의 연구에서 우수한 모델 유기체임을 보여주었습니다. 특히, Drosophila는 인간과 고도로 보존된 신진 대사 유전자를 공유하고 지질 물질 대사를 위한 유사한 관련 조직/기관 및 세포 모형을 소유합니다.
예를 들어, 트리 아 실 글리세라이드 저장에 대 한 책임은 Drosophila의지방 체, 인간의 지방 조직과 유사한 기능. 최근, 인간 간과 기능성 유사체로 보고된 전문 간세포형 세포(즉, 에노세포)의 클러스터는 과일 파리에서 지방산 및 탄화수소 대사에 관여하는 것으로 나타났다4,5. 포유류 간에서와 유사하게, oenocytes는 애벌레와 성인 Drosophila둘 다에 있는 지질 방울 대형을 활성화해서 기아에 반응합니다, oenocytes에 있는 지질 방울 축적의 결과로4,6,7,8. 해부학적으로, oenocytes는 복부 hemisegment 당 대략 6개의 세포의 클러스터에 있는 측방 표피의 기저 내부 표면에 단단히 붙어, 이는 표피에서 oenocyte 군집을 격리하는 것을 실행 불가능하게 합니다. 따라서, oenocytes는 해부 및 염색 도중 표피에 부착되어야 합니다.
지질은 세포9의단층 막을 가진 세포기관인 지질 방울의 형태로 저장됩니다. 지질 방울은 다른 종에 걸쳐 거의 모든 세포 유형에 존재10. 지질 방울 역학, 그것의 크기와 수를 포함 하 여, 환경 스트레스에 대 한 응답에서 변경. 이는 노화및기아와같은 스트레스에 반응하여 대사 상태를 반영한 것으로7,8. 따라서, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 oenocytes에서 지질 방울 역학을 질적으로 결정하는 실현 가능하고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 특히, 제3 인스타 유충에서, oenocytes는 공급 조건 하에서 검출 가능한 지질 방울을 거의 또는 전혀 함유하지 않지만, 영양 부족 후 수많은 큰 지질 방울을 함유한다4. 이 방법의 효과를 확인하기 위해, 굶주린 조건하에서 에노 세포에서 지질 방울 염색을 수행하는 것이 좋습니다.
현재, 몇몇 친유성 염료는 불형색 염료 수단 블랙 및 오일 레드 O 및 형광 염료 나일 레드 및 BODIPY 493/50311과같은 지질 방울 염색에 사용할 수 있다. 수단 블랙과 오일 레드 O는 일반적으로 조직 콜레스테릴 에스테르와 트리 아실 글리세롤에 사용되며 가벼운 현미경 검사법에 의해 쉽게 검출 될 수있다. 그러나, 상대적으로 높은 배경 염색 및 상대적으로 낮은 해상도는 지질 액적 역학의 질적 분석에서 그것의 응용에 대한 두 가지 제한 요인이다. 비형광 염료의 한계를 극복하기 위해 나일 레드와 BODIPY 493/503은 지질 방울 염색을 위한 이상적인 대체품으로 활용됩니다. 나일 레드는 또한 BODIPY 493/503 세포 지질 방울에 대 한 더 구체적인 염료를 만드는 일부 unesterified 콜레스테롤을 감지할 수 있다 보고되었습니다.,어느 정도12,13,14.
무엇보다도, 이 프로토콜은 oenocytes에 있는 지질 방울의 신속하고 민감한 분석에 대한 필요를 충족하기 위하여, 얼룩 염료로 BODIPY 493/503를 사용하여 고착성 지질 방울 특정 염색의 실현 가능하고 고도로 재현 가능한 방법을 제시합니다. 이 보고에서는, oenocytes는 해부되고, BODIPY 493/503는 공초점 현미경 검사법에 의해 지질 방울이 검출되는 oenocytes에 있는 지질 작은 물방울 염색을 위해 이용됩니다. 이 절차의 용이성과 경제성은 유세포 측정과 같은 다른 응용 분야에서 수정 및 추가 사용에 이상적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 것 중에는 이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 계란 누워 기간은 이들 중 하나입니다. 지질 동원 조직으로서, 에노세포는 영양 상태에 매우 민감하다6,8. 장기간 계란 누워 기간 까마귀 애벌레 와 증가 식품 경쟁 귀 착될 수 있습니다., 부정확 한 결과 선도. 이 프로토콜에 사용되는 1 시간 계란 누워 기간은 유충이 영양 경쟁없이 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 중국 국립자연과학재단(31671422, 31529004, 31601112), 111프로젝트(D18010), 광동펄강 인재프로그램(2017BT01S155) 및 중국 박사 후 과학 재단 (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
