Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila
Summary
Aqui são apresentados métodos detalhados para a dissecação e mancha de gotícula lipídica de estenocitos em larvas de Drosophila usando BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotícula lipídica.
Abstract
Os lipídios são essenciais para o desenvolvimento animal e a homeostase fisiológica. A desregulação do metabolismo lipídico resulta em vários defeitos e doenças do desenvolvimento, como obesidade e fígado gorduroso. Normalmente, os lipídios são armazenados em gotículas lipídicas, que são as organelas de armazenamento lipídico multifuncionais nas células. As gotículas lipídicas variam em tamanho e número em diferentes tecidos e diferentes condições. Tem sido relatado que as gotículas lipídicas são rigidamente controladas através da regulação de sua biogênese e degradação. Em Drosophila melanogaster,o enocito é um tecido importante para o metabolismo lipídico e foi recentemente identificado como um análogo de fígado humano sobre a mobilização lipídica em resposta ao estresse. No entanto, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo das gotículas lipídicas nos enocitos permanecem evasivos. Para resolver este problema, é de extrema importância desenvolver um método confiável e sensível para visualizar diretamente as mudanças dinâmicas de gotículas lipídicas nos enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Aproveitando o LIPophilic BODIPY 493/503, um corante fluorescente específico da gotídea lipídica, descrito aqui é um protocolo detalhado para a dissecação e a mancha lipídica subseqüente na mancha de enocícitos das larvas de Drosophila em resposta à fome. Isso permite a análise qualitativa da dinâmica de gotículas lipídicas várias condições pela microscopia confocal. Além disso, este método rápido e altamente reproduzível também pode ser usado em telas genéticas para identificar novos fatores genéticos envolvendo o metabolismo das gotículas lipídicas em enocitos e outros tecidos.
Introduction
Os lipídios são essenciais para a sobrevivência celular. Além de seu papel tradicional como componentes integrais dos sistemas de membrana celular, os lipídios também desempenham funções cruciais no fornecimento de energia e sinalização transduction ao longo dos ciclos de vida de animais individuais1. Assim, o metabolismo lipídico deve estar em conformidade com regulamentos rigorosos para manter a hemostase fisiológica nas células. Sabe-se que a desregulação do metabolismo lipídico resulta em várias doenças, como diabetes e fígado gorduroso. Apesar da grande importância do metabolismo lipídico na saúde animal, os mecanismos subjacentes à regulação do metabolismo lipídico permanecem em grande parte desconhecidos.
Drosophila tem sido amplamente utilizado há anos desde que o professor Thomas H. Morgan começou a usá-los em estudos envolvendo genética e outras questões biológicas básicas2. Nas últimas décadas, evidências emergentes mostraram que a Drosophila é um excelente organismo modelo no estudo de muitas doenças associadas ao metabolismo lipídico, como a obesidade1,3. Em particular, Drosophila compartilha genes metabólicos altamente conservados com seres humanos e possuem tecidos/órgãos e tipos de células relevantes semelhantes para o metabolismo lipídico.
Por exemplo, o corpo gordo de Drosophila,que é responsável pelo armazenamento de triacylgliceres, funciona análogo ao tecido adiposo humano. Recentemente, um aglomerado de células especializadas hepatocito-like (ou seja, enocitos), que foram relatados para ser um análogo funcional para o fígado humano, têm sido mostrados para estar envolvido em ácidos graxos e metabolismo de hidrocarbonetos em moscas de fruta4,5. Semelhante ao caso em fígados de mamíferos, os enocitos respondem à fome ativando a formação de gotículas lipídicas em Drosophilalarval e adulto, resultando em acúmulo de gotículas lipídicas em enocitos4,6,7,8. Anatomicamente, os enocícitos estão firmemente ligados à superfície interna basana da epiderme lateral em aglomerados de aproximadamente seis células por hemisegmento abdominal, o que o torna impraticável isolar aglomerados de enocitos da epiderme. Assim, os enocitos devem ser anexados à epiderme durante a dissecação e coloração.
Os lipídios são armazenados na forma de gotículas lipídicas, que são organelas com membranas de camada única nas células9. Gotículas lipídicas existem em quase todos os tipos de células em diferentes espécies10. A dinâmica das gotículas lipídicas, incluindo seu tamanho e número, muda em resposta aos estressores ambientais. Isto é considerado como um reflexo do estado metabólico em resposta ao estresse, como envelhecimento e fome7,8. Portanto, é de grande importância desenvolver um método viável e confiável para determinar qualitativamente a dinâmica das gotículas lipídicas em enocitos durante o desenvolvimento e em condições estressantes. Em particular, nas terceiras larvas instaras, os enocitos contêm poucas ou nenhumas gotículas lipídicas detectáveis em condições alimentadas, mas contêm inúmeras gotículas lipídicas grandes após a privação nutricional4. Para verificar a eficácia deste método, sugere-se para realizar a mancha de gotícula lipídica nos enocitos em condições de fome.
Atualmente, vários corantes lipofílicos estão disponíveis para manchas lipídicas, como as corantes não fluorescentes Sudan Black e Oil Red O e corantes fluorescentes Nile Red e BODIPY 493/50311. Sudão Preto e Óleo Vermelho O são comumente usados para estersio de cholesteryl de tecido e triacylglicerols e podem ser facilmente detectados por microscopia de luz. No entanto, a coloração de fundo relativamente alta e a resolução relativamente baixa são dois fatores limitantes para suas aplicações na análise qualitativa da dinâmica das gotículas lipídicas. Para superar as limitações de corantes não fluorescentes, O Vermelho do Nilo e bodipy 493/503 são utilizados como substitutos ideais para a coloração de gotículas lipídicas. Tem sido relatado que o Vermelho do Nilo também pode detectar algum colesterol não-esterified, o que torna BODIPY 493/503 um corantes mais específicos para gotículas lipídicas celulares, até certo ponto12,13,14.
Acima de tudo, para atender à necessidade de uma análise rápida e sensível de gotículas lipídicas em enocitos, este protocolo apresenta um método viável e altamente reproduzível de manchas lipídicas baseadas em fixação usando BODIPY 493/503 como corante de mancha. Neste relatório, os enocitos são dissecados, e BODIPY 493/503 é usado para manchas de gotículas lipídicas nos enocitos, em que gotículas lipídicas são detectadas por microscopia confocal. A facilidade e acessibilidade deste procedimento torná-lo ideal para modificação e uso adicional em outras aplicações, tais como citometria de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entre os descritos acima, há vários passos críticos neste protocolo, com o período de tempo de postura de ovos sendo um desses. Como um tecido de mobilização lipídica, o enocito é altamente sensível ao estado nutricional6,8. Períodos prolongados de tempo de postura de ovos podem resultar em larvas de canto e aumento da concorrência alimentar, levando a resultados imprecisos. O período de tempo de postura de ovos de 1 h usado neste protocolo permite qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 e 31601112), do Projeto 111 (D18010), do Projeto local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de Equipes Inovadoras e de Pesquisa do Programa de Talentos do Rio Guangdong Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S155) e do Programa local de talentos do rio Perl (2017BT01S1555) e do China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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