果蝇幼虫的欧诺细胞的解剖和脂滴染色
Summary
这里介绍了使用BODIPY 493/503（一种脂滴特异性荧光染料）对果蝇幼虫中的卵虫细胞进行解剖和脂滴染色的详细方法。
Abstract
脂质对动物发育和生理平衡至关重要。脂质代谢紊乱会导致各种发育缺陷和疾病，如肥胖和脂肪肝。通常，脂质储存在脂液滴中，这是细胞中的多功能脂质储存细胞。脂液滴在不同组织和不同条件下的大小和数量各不相同。据报道，脂液滴通过调节其生物发生和降解受到严格控制。在果蝇黑色素组，卵细胞是脂质代谢的重要组织，最近被确定为人类肝脏模拟脂质动员对压力的反应。然而，调节卵细胞中脂滴代谢的机制仍然难以捉摸。为了解决这个问题，最重要的是开发一种可靠而敏感的方法，直接可视化在发育和压力条件下的卵细胞脂滴动态变化。利用亲脂BODIPY 493/503，一种脂液滴特异性荧光染料，这里描述的是一个详细的方案，用于在果蝇幼虫的卵虫细胞中解剖和随后的脂液滴染色，以应对饥饿。这允许通过共聚焦显微镜对不同条件下的脂质滴动力学进行定性分析。此外，这种快速且高度可重复的方法也可用于基因筛选，用于识别涉及卵细胞和其他组织脂滴代谢的新型遗传因子。
Introduction
脂质是细胞生存所必需的。除了它们作为细胞膜系统的组成部分的传统角色外，脂质在单个动物的生命周期中，在能源供应和信号转导中也起着至关重要的作用。因此，脂质代谢必须符合严格的规定，以保持细胞的生理血质。众所周知，脂质代谢调节不良会导致各种疾病，如糖尿病和脂肪肝。尽管脂质代谢在动物健康中非常重要，但脂质代谢调节机制在很大程度上仍不为人所知。
自从托马斯·摩根教授开始将其用于涉及遗传学和其他基本生物学问题的研究中，果蝇已经广泛使用多年。在过去的几十年里，新的证据表明，果蝇是研究许多脂质代谢相关疾病的优秀模型生物体，如肥胖1，3。特别是，果蝇与人类共享高度保守的代谢基因，并拥有类似的相关组织/器官和细胞类型进行脂质代谢。
例如，负责三乙基甘油储存的果蝇脂肪体，其功能类似于人体脂肪组织。最近，一组专门的肝细胞状细胞（即欧细胞），已报告是人体肝脏的功能模拟，已被证明参与脂肪酸和碳氢化合物代谢在果蝇4，5。与哺乳动物肝脏类似，卵虫细胞通过激活幼虫和成年果蝇的脂滴形成来应对饥饿，导致卵虫细胞4、6、7、8的脂滴积累。从解剖学上讲，卵核细胞紧密地附着在侧表皮的基底内表面，每个腹部半部分大约六个细胞簇，这使得从表皮中分离出卵细胞簇变得不可行。因此，在解剖和染色期间，必须将卵细胞附着在表皮上。
脂质以脂滴的形式储存，这是细胞9中具有单层膜的细胞器。脂液滴存在于不同物种10的几乎所有细胞类型中。脂滴动力学，包括其大小和数量，会因环境压力因素而发生变化。这被认为是对压力（如衰老和饥饿7，8）的代谢状态的反映。因此，开发一种可行、可靠的方法，在发育过程中和压力条件下定性确定卵细胞中的脂滴动力学，具有十分重要的意义。特别是，在第三星幼虫中，在饲料条件下，卵虫细胞含有很少或根本没有可检测到的脂滴，但它们确实含有大量大脂滴后营养剥夺4。为了验证这种方法的有效性，建议在饥饿条件下在卵细胞中进行脂滴染色。
目前，几种亲脂染料可用于脂滴染色，如非荧光染料苏丹黑和油红O和荧光染料尼罗河红和BODIPY 493/50311。苏丹黑和油红O通常用于组织胆碱酯和三乙基甘油，可以很容易地通过光显微镜检测。然而，相对较高的背景染色和相对较低的分辨率是其在脂滴动力学定性分析中的应用的两个限制因素。为了克服非荧光染料的局限性，尼罗河红和BODIPY 493/503被用作脂滴染色的理想替代品。据报道，尼罗河红也可以检测出一些未酯化的胆固醇，这使得BODIPY 493/503在细胞脂液滴中具有更具体的染料，在某种程度上是12、13、14。
首先，为了满足对卵细胞中脂滴进行快速和灵敏分析的需要，该协议提出了一种可行且高度可重复的固定基脂滴特异性染色方法，使用BODIPY 493/503作为染色染料。在本报告中，对卵细胞进行了解剖，BODIPY 493/503用于在卵细胞中进行脂滴染色，其中脂液滴通过共聚焦显微镜检测。此过程的简便性和可负担性使其非常适合在流式细胞仪等其他应用中进行修改和进一步使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
在上述协议中，此协议中有几个关键步骤，其中产卵周期就是其中之一。作为脂质动员组织，欧细胞对营养状态6、8高度敏感。产卵时间延长可能导致幼虫被叫，增加食物竞争，导致结果不准确。本议定书中使用的1小时产卵期允许幼虫在没有营养竞争的情况下发育。由于产卵时间较长，可能导致的幼虫数量要大得多，也可能影响卵细胞中的脂质滴量和?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（31671422、31529004和31601112）、111项目（D18010）、广东珀尔河人才计划地方创新与研究团队项目（2017BT01S155）和中国博士后科学基金会（2018M640767）。
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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