Dissektion og lipid dråbe farvning af Oenocytter i Drosophila larver
Summary
Præsenteret her er detaljerede metoder til dissektion og lipid dråbe farvning af oenocytter i Drosophila larver ved hjælp af bodipy 493/503, en lipid dråbe specifik fluorescerende farvestof.
Abstract
Lipider er afgørende for dyrenes udvikling og fysiologiske homøostase. Dysregulering af lipid metabolisme resulterer i forskellige udviklingsmæssige defekter og sygdomme, såsom fedme og fedt lever. Normalt er lipider lagret i lipid dråber, som er de multifunktionelle Lipid opbevaring organeller i celler. Lipid dråber varierer i størrelse og antal i forskellige væv og under forskellige forhold. Det er blevet rapporteret, at lipid dråber er stramt kontrolleret gennem regulering af dets Biogenese og nedbrydning. I Drosophila melanogaster, den oenocyte er en vigtig væv for lipid metabolisme og er for nylig blevet identificeret som en menneskelig lever analog vedrørende lipid mobilisering som reaktion på stress. Men de mekanismer, som er grundlaget for reguleringen af lipid dråbe metabolisme i oenocytter forbliver undvigende. For at løse dette problem, det er af yderste vigtighed at udvikle en pålidelig og følsom metode til direkte visualisere lipid dråbe dynamiske ændringer i oenocytter under udvikling og under stressende forhold. Drage fordel af den lipofile bodipy 493/503, en lipid dråbe-specifikke fluorescerende farvestof, beskrevet her er en detaljeret protokol for dissektion og efterfølgende lipid dråbe farvning i oenocytes af Drosophila larver som reaktion på sult. Dette giver mulighed for kvalitativ analyse af lipid dråbe dynamik under forskellige betingelser ved Konfokal mikroskopi. Desuden kan denne hurtige og meget reproducerbare metode også anvendes i genetiske skærme til at identificere nye genetiske faktorer, der involverer lipid dråbe metabolisme i oenocytter og andre væv.
Introduction
Lipider er afgørende for cellens overlevelse. Ud over deres traditionelle rolle som integrerede komponenter i cellulære membransystemer, også lipiderne spiller afgørende funktioner i energiforsyningen og signalering transduktion i hele livscyklussen for de enkelte dyr1. Således, lipid metabolisme skal overholde strenge regler for at opretholde fysiologiske hæmostase i celler. Det er kendt, at dysregulering af lipid metabolisme resulterer i forskellige sygdomme, såsom diabetes og fedt lever. På trods af den store betydning af lipid metabolisme i dyresundhed, de mekanismer underliggende lipid metabolisme regulering forbliver stort set ukendt.
Drosophila har været flittigt brugt i årevis siden professor Thomas H. Morgan begyndte at bruge dem i undersøgelser, der involverer genetik og andre grundlæggende biologiske spørgsmål2. I de sidste par årtier, nye beviser har vist, at Drosophila er en fremragende model organisme i studiet af mange lipid metabolisme-associerede sygdomme, såsom fedme1,3. Især, Drosophila deler stærkt bevaret metaboliske gener med mennesker og besidder lignende relevante væv/organer og celletyper for lipid metabolisme.
For eksempel, fedt kroppen af Drosophila, som er ansvarlig for triacylglycerid opbevaring, funktioner svarende til humant fedtvæv. For nylig, en klynge af specialiserede hepatocyte-lignende celler (dvs., oenocytter), som er blevet rapporteret til at være en funktionel analog til den menneskelige lever, har vist sig at være involveret i fedtsyre og kulbrinte metabolisme i frugt fluer4,5. Svarende til tilfældet i pattedyr lever, oenocytter reagere på sult ved at aktivere lipid dråbedannelse i både larve og voksne Drosophila, resulterer i lipid dråbe ophobning i oenocytter4,6,7,8. Anatomisk, oenocytter er tæt knyttet til basal indre overflade af laterale epidermis i klynger af ca seks celler pr abdominal hemisegment, hvilket gør det praktisk umuligt at isolere oenocyte klynger fra epidermis. Derfor skal oenocytter være fastgjort til epidermis under dissektion og farvning.
Lipider er lagret i form af lipid dråber, som er organeller med enkeltlags membraner i cellerne9. Lipid dråber findes i næsten alle celletyper på tværs af forskellige arter10. Lipid dråbe dynamik, herunder dens størrelse og antal, ændring som reaktion på miljømæssige stressorer. Dette betragtes som en afspejling af metaboliske status som reaktion på stress, såsom aldring og hungersnød7,8. Derfor er det af stor betydning at udvikle en gennemførlig og pålidelig metode til kvalitativt bestemme lipid dråbe dynamik i oenocytter under udvikling og under stressende forhold. Især i den tredje INSTAR larver indeholder oenocytter få eller ingen påviselige lipid dråber under fodret betingelser, men de indeholder talrige store lipid dråber efter ernæring afsavn4. For at verificere effektiviteten af denne metode, foreslås det at udføre lipid dråbe farvning i oenocytes under sultede betingelser.
I øjeblikket er flere lipofile farvestoffer tilgængelige for lipid dråber farvning, såsom nonfluorescerende farvestoffer Sudan sort og olie rød O og fluorescerende farvestoffer Nile Red og BODIPY 493/50311. Sudan sort og olie rød O er almindeligt anvendt til vævs kolesterylestere estere og triacylglyceroler og kan let påvises ved lys mikroskopi. Men relativt høj baggrunds farvning og relativt lav opløsning er to begrænsende faktorer for dets anvendelser i kvalitativ analyse af lipid dråbe dynamik. For at overvinde begrænsningerne af nonfluorescerende farvestoffer, er Nilen rød og BODIPY 493/503 udnyttes som ideelle erstatninger for lipid dråbe farvning. Det er blevet rapporteret, at Nile Red også kan detektere nogle unesterificeret kolesterol, hvilket gør bodipy 493/503 et mere specifikt farvestof til cellulære lipid dråber, til en vis grad12,13,14.
Frem for alt, at opfylde et behov for hurtig og følsom analyse af lipid dråber i oenocytter, denne protokol præsenterer en gennemførlig og meget reproducerbar metode til fiktivt-baserede lipid dråbe-specifikke farvning ved hjælp af BODIPY 493/503 som plet farvestof. I denne rapport, er oenocytter dissekeret, og BODIPY 493/503 bruges til lipid dråbe farvning i oenocytes, hvor lipid dråber opdages ved Konfokal mikroskopi. Den lethed og overkommelige i denne procedure gør den ideel til modifikation og yderligere brug i andre applikationer, såsom flow cytometry.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blandt de ovenfor beskrevne, er der flere kritiske trin i denne protokol, med æglægnings tiden periode er en af disse. Som et lipid-mobiliserende væv, er oenocyte meget følsom over for ernæringstilstand6,8. Forlængede æglægnings tider kan resultere i kronede larver og øget fødevare konkurrence, hvilket fører til unøjagtige resultater. Den 1 h æglægningsperiode, der anvendes i denne protokol, gør det muligt for larverne at udvikle sig uden ernæring…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (31671422, 31529004 og 31601112), 111-projektet (D18010), det lokale innovative og forsker teams projekt af Guangdong Perl River Talents program (2017BT01S155), og China postdoc Science Foundation (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
