Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven
Summary
Hier werden detaillierte Methoden zur Zerlegung und Lipidtröpfchenfärbung von Önozyten in Drosophila-Larven mit BODIPY 493/503, einem Lipidtropfen-spezifischen fluoreszierenden Farbstoff, vorgestellt.
Abstract
Lipide sind wichtig für die Entwicklung der Tiere und physiologische Homöostase. Dysregulation des Fettstoffwechsels führt zu verschiedenen Entwicklungsfehlern und Krankheiten, wie Fettleibigkeit und Fettleber. In der Regel werden Lipide in Lipidtröpfchen gespeichert, die die multifunktionalen Lipidspeicherorganellen in Zellen sind. Lipidtröpfchen variieren in Größe und Anzahl in verschiedenen Geweben und unter verschiedenen Bedingungen. Es wurde berichtet, dass Lipidtröpfchen durch Regulierung seiner Biogenese und Abbau streng kontrolliert werden. Bei Drosophila melanogasterist das Onozyten ein wichtiges Gewebe für den Fettstoffwechsel und wurde vor kurzem als menschliches Leberanalogon in Bezug auf die Lipidmobilisierung als Reaktion auf Stress identifiziert. Die Mechanismen, die der Regulierung des Lipidtröpfchenstoffwechsels in Oenozyten zugrunde liegen, bleiben jedoch schwer fassbar. Um dieses Problem zu lösen, ist es von größter Bedeutung, eine zuverlässige und empfindliche Methode zu entwickeln, um dynamische Veränderungen des Lipidtröpfchens in Oenozyten während der Entwicklung und unter stressigen Bedingungen direkt zu visualisieren. Unter Ausnutzung der lipophilen BODIPY 493/503, einem lipidtropfenspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, wird hier ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung und anschließende Lipidtröpfchenfärbung in den Önozyten von Drosophila-Larven als Reaktion auf Hunger beschrieben. Dies ermöglicht eine qualitative Analyse der Lipidtröpfchendynamik unter verschiedenen Bedingungen durch konfokale Mikroskopie. Darüber hinaus kann diese schnelle und hochreproduzierbare Methode auch in genetischen Screens zur Indentifizierung neuartiger genetischer Faktoren verwendet werden, die den Fetttropfenstoffwechsel in Oenozyten und anderen Geweben beinhalten.
Introduction
Lipide sind für das Überleben der Zelle unerlässlich. Neben ihrer traditionellen Rolle als integrale Bestandteile zellulärer Membransysteme spielen Lipide auch entscheidende Funktionen in der Energieversorgung und Signaltransduktion über die Lebenszyklen einzelner Tiere1. Daher muss der Fettstoffwechsel strengen Vorschriften entsprechen, um die physiologische Hämostase in den Zellen aufrechtzuerhalten. Es ist bekannt, dass die Dysregulation des Fettstoffwechsels zu verschiedenen Krankheiten führt, wie Diabetes und Fettleber. Trotz der großen Bedeutung des Fettstoffwechsels für die Tiergesundheit bleiben die Mechanismen, die der Lipidstoffwechselregulation zugrunde liegen, weitgehend unbekannt.
Drosophila wird seit Jahren ausgiebig verwendet, seit Professor Thomas H. Morgan begann, sie in Studien mit Genetik und anderen grundlegenden biologischen Fragen zu verwenden2. In den letzten Jahrzehnten hat sich gezeigt, dass Drosophila ein ausgezeichneter Modellorganismus in der Studie vieler Lipidstoffwechsel-assoziierten Krankheiten ist, wie Fettleibigkeit1,3. Insbesondere teilt Drosophila hochkonservierte stoffwechselgene mit Menschen und besitzt ähnliche relevante Gewebe/Organe und Zelltypen für den Fettstoffwechsel.
Zum Beispiel, der Fettkörper von Drosophila, die für Triacylglycerid Lagerung verantwortlich ist, funktionen analog zum menschlichen Fettgewebe. Kürzlich hat sich gezeigt, dass ein Cluster spezialisierter Hepatozyten-ähnlicher Zellen (d. h. Oenozyten), die nachweislich ein funktionelles Analogon zur menschlichen Leber sind, am Fettsäure- und Kohlenwasserstoffstoffwechsel in Fruchtfliegen beteiligt ist4,5. Ähnlich wie bei Säugetierlebern reagieren Onozyten auf Hunger, indem sie die Lipidtröpfchenbildung sowohl bei Larven als auch bei erwachsenen Drosophilaaktivieren, was zu einer Fetttröpfchenakkumulation in den Önozyten4,6,7,8führt. Anatomisch sind Oenozyten in Clustern von etwa sechs Zellen pro Bauchhalbteil eng an der basalen Innenfläche der lateralen Epidermis befestigt, was es undurchführbar macht, Oenozytencluster von der Epidermis zu isolieren. Daher müssen Oenozyten während der Zerlegung und Färbung an der Epidermis befestigt werden.
Lipide werden in Form von Lipidtröpfchen gelagert, die Organellen mit einschichtigen Membranen in Zellen9sind. Lipidtröpfchen gibt es in fast allen Zelltypen verschiedener Arten10. Lipid-Tröpfchen-Dynamik, einschließlich seiner Größe und Anzahl, ändern sich als Reaktion auf Umweltstressoren. Dies wird als Spiegelbild des metabolischen Zustands als Reaktion auf Stress, wie Alterung und Hunger7,8betrachtet. Daher ist es von großer Bedeutung, eine praktikable und zuverlässige Methode zur qualitativen Bestimmung der Lipidtröpfchendynamik in Oenozyten während der Entwicklung und unter stressigen Bedingungen zu entwickeln. Insbesondere in der dritten Instar-Larven enthalten Oenozyten unter gefütterten Bedingungen nur wenige oder keine nachweisbaren Lipidtröpfchen, aber sie enthalten zahlreiche große Lipidtröpfchen nach Ernährungsentzug4. Um die Wirksamkeit dieser Methode zu überprüfen, Es wird vorgeschlagen, Lipid Tröpfchen Färbung in den Oenozyten unter verhungerten Bedingungen durchzuführen.
Derzeit sind mehrere lipophile Farbstoffe für Lipidtröpfchen färbung verfügbar, wie die nichtfluoreszierenden Farbstoffe Sudan Black und Oil Red O und fluoreszierende Farbstoffe Nile Red und BODIPY 493/50311. Sudan Schwarz und Öl Rot O werden häufig für Gewebe-Cholesterylester und Triacylglycerole verwendet und können leicht durch Lichtmikroskopie erkannt werden. Relativ hohe Hintergrundfärbung und relativ geringe Auflösung sind jedoch zwei einschränkende Faktoren für seine Anwendungen in der qualitativen Analyse der Lipidtröpfchendynamik. Um die Grenzen von nichtfluoreszierenden Farbstoffen zu überwinden, werden Nile Red und BODIPY 493/503 als ideale Ersatzstoffe für Lipidtröpfchenfärbung eingesetzt. Es wurde berichtet, dass Nile Red auch einige unesterifizierte Cholesterin erkennen kann, was BODIPY 493/503 zu einem spezifischeren Farbstoff für zelluläre Lipidtröpfchen macht, bis zu einem gewissen Grad12,13,14.
Um vor allem den Bedarf an einer schnellen und sensiblen Analyse von Lipidtröpfchen in Oenozyten zu erfüllen, stellt dieses Protokoll eine praktikable und hochreproduzierbare Methode der fixativen Lipidtröpfchen-spezifischen Färbung mit BODIPY 493/503 als Fleckenfarbstoff dar. In diesem Bericht werden Oenozyten seziert, und BODIPY 493/503 wird für Lipidtröpfchenfärbung in den Oenozyten verwendet, bei denen Lipidtröpfchen durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden. Die Leichtigkeit und Erschwinglichkeit dieses Verfahrens machen es ideal für Modifikationen und den weiteren Einsatz in anderen Anwendungen, wie z. B. Durchflusszytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter den oben beschriebenen gibt es mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, wobei der Zeitraum der Eiablage einer davon ist. Als Lipid-mobilisierendes Gewebe ist die Onozyten hochempfindlich gegenüber dem Ernährungsstatus6,8. Längere Eislegerzeiten können zu krähigen Larven und einem verstärkten Lebensmittelwettbewerb führen, was zu ungenauen Ergebnissen führen kann. Die in diesem Protokoll verwendete 1 h Eilegezeit erlaubt es den Larven, sich oh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31671422, 31529004 und 31601112), das 111 Project (D18010), das Local Innovative and Research Teams Project of Guangdong Perl River Talents Program (2017BT01S155) und das China Postdoctoral Science Foundation (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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