Effektivt transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem for undersøkelse av stabiliteten av mRNA transkripsjoner i primær alveorisk epitelceller

Summary

Her presenterer vi et verktøy som kan brukes til å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon i primære alveolære epitelceller ved hjelp av et utilbørlig uttrykkssystem koblet til en pipetteelektroporasjonsteknikk.

Abstract

Å studere posttranskripsjonsregulering er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gitt budbringer RNA (mRNA) og dens innvirkning på cellehomeostase og metabolisme. Faktisk kan svingninger i transkripsjonsuttrykk endre oversettelseseffektiviteten og til slutt den cellulære aktiviteten til en transkripsjon. Flere eksperimentelle tilnærminger er utviklet for å undersøke halveringstiden til mRNA, selv om noen av disse metodene har begrensninger som forhindrer riktig studie av posttranskripsjonsmodulasjon. Et promotorinduksjonssystem kan uttrykke et gen av interesse under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert promotor. Denne metoden tillater halveringstidestimering av en gitt mRNA under enhver eksperimentell tilstand uten forstyrrende celle homeostase. En stor ulempe med denne metoden er nødvendigheten av transfect celler, som begrenser bruken av denne teknikken i isolerte primære celler som er svært motstandsdyktigmot konvensjonelle transfection teknikker. Alveolære epitelceller i primærkulturen har blitt brukt mye for å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. De unike egenskapene og fenotypen til primære alveolære celler gjør det viktig å studere posttranskripsjonsmodulasjonene av gener av interesse i disse cellene. Derfor var vårt mål å utvikle et nytt verktøy for å undersøke posttranskripsjonsmodulasjonene til mRNAs av interesse for alveoriske epitelceller i primærkulturen. Vi designet en rask og effektiv forbigående transfection protokoll for å sette inn et transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem i primære alveolære epitelceller. Denne kloningstrategi, ved hjelp av en viral epitope for å tagge konstruksjonen, gjør det mulig for enkel diskriminering av konstruere uttrykk fra endogene mRNAs. Ved hjelp av en modifisert ΔΔ quantification syklus (Cq) metode, kan uttrykket av transkripsjonen deretter kvantifiseres med forskjellige tidsintervaller for å måle halveringstiden. Våre data viser effektiviteten av denne nye tilnærmingen i å studere posttranskripsjonsregulering i ulike patofysiologiske forhold i primære alveolære epitelceller.

Introduction

Flere teknikker er utviklet for å bestemme halveringstiden til mRNAs. Pulsjagende forfallsteknikk, som benytter merkede mRNAer, gjør det mulig å samtidig evaluering av et stort basseng av mRNAer med minimal cellulær forstyrrelse. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke en direkte estimering av halveringstiden til en enkelt gentranskripsjon og kan ikke implementeres for å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en mRNA etter stimulering med vekstfaktorer, ROS, alarmer eller betennelse¹.

Bruk av transkripsjonshemmere, som actinomycin D og α-amanitin, er en relativt enkel metode for måling av mRNA nedbrytningskinetikk over tid. En stor fordel med denne tilnærmingen over tidligere teknikker, (dvs. pulsjakt) er avhengig av evnen til å direkte estimere halveringstiden til en gitt transkripsjon og sammenligne hvordan ulike behandlinger kan påvirke nedbrytningskinetikken. Den betydelige skadelige virkningen av transkripsjonshemmere på cellefysiologi representerer imidlertid en stor ulempe for tilnærmingen². Faktisk har hemmingen av hele celletranskripsjonen med disse stoffene den negative bivirkningen av å perturbing syntesen av viktige elementer involvert i mRNA stabilitet, som microRNAs (miRNAs), samt uttrykk og syntese av RNA-bindende proteiner, som er viktige for mRNA nedbrytning og stabilitet. Den alvorlige perturbasjonen av gentranskripsjon av disse legemidlene kan derfor artefactually endre nedbrytningskurvene av transkripsjoner.

Arrangørens induksjonssystem representerer en tredje tilnærming for å måle halveringstiden til en bestemt mRNA. Denne metoden måler nedbrytningen av en bestemt mRNA på samme måte som metoder som bruker transkripsjonshemmere. To typer induksjonssystemer brukes ofte: serumindusert c-fos-promotor³ og Tet-Off induserbart system⁴. Med c-fos-systemet er bruk av transkripsjonshemmere som kan være giftige for cellen ikke nødvendig. Denne metoden krever imidlertid synkronisering av cellesyklus, som forhindrer evaluering av den faktiske stabiliteten til en transkripsjon under interfase⁵. I motsetning tillater Tet-Off-systemet det sterke uttrykket av genet av interesse (GOI) under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert arrangør. Dette systemet krever tilstedeværelse av to elementer som må være cotransfected inn i cellen for å være funksjonell. Den første plasmid (pTet-Off) uttrykker det regulatoriske proteinet tTA-Adv, en hybrid syntetisk transkripsjonsfaktor som består av den prokaryotiske undertrykkeren TetR (fra Escherichia coli) smeltet til tre transkripsjonstransaktiveringsdomener fra det virale proteinet HSV VP16. GOI er klonet inn i pTRE-Tight plasmid under kontroll av en syntetisk promotor (P_Tight),bestående av den minimale sekvensen av cytomegalovirus (CMV) arrangør smeltet til syv gjentakelser av tetO operatør sekvens. Transkripsjonen av genet nedstrøms av P_Tight er avhengig av samspillet mellom TetR med tetO. I nærvær av tetracyklin eller dets derivat, doxycyklin, mister TetR-undertrykkeren sin affinitet for tetO-operatøren, noe som fører til en opphør av transkripsjon⁴. Egenskapene til Tet-Off-systemet gjør det til en ideell modell for studiet av spesifikke mRNA-uttrykk i eukaryyotiske celler samtidig som det unngår potensielle pleiotropiske effekter som er sekundære til fraværet av prokaryotiske regulatoriske sekvenser i eukaryotisk celle⁶. Vanligvis brukes dobbelt stabile Tet-Off cellelinjer (HEK 293, HeLa og PC12) med dette systemet til å integrere kopier av regulatoren og responsplasmider for praktisk tilgang til kontrollerbart genuttrykk^7,8,9.

Flere modeller av alveolære epitelceller i kulturen har blitt brukt til å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. I årevis har forskere i stor grad utnyttet menneskelige eller gnagerprimære celler^10,11 samt udødelige cellelinjer som menneskelig A549 eller rotte RLE-6TN celler^12,13. Selv om de generelt er mindre proliferative og vanskeligere å kultur og transfect, alveolære epitelceller i primærkulturen forblir gullstandarden for studiet av funksjonen og dysfunksjonen av alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold. Faktisk viser udødeliggjortcellelinjer som A549-celler ikke de komplekse egenskapene og fenotypene til primærceller, mens alveorene epitelceller i primærkultur rekapitulerer hovedegenskapene til alveolærepitelet, spesielt evnen til å danne en polarisert og stram barriere^14,15. Dessverre er disse cellene svært motstandsdyktige mot konvensjonelle transfection teknikker, for eksempel de som bruker liposomer, noe som gjør bruk av et promotor-indusert system som Tet-Off svært vanskelig.

Den posttranskripsjonelle moduleringen av mRNAs er en av de mest effektive metodene for raskt å modulere genuttrykket til en transkripsjon¹⁶. MRNA 3′ uoversatte region (3′ UTR) spiller en viktig rolle i denne mekanismen. Det har vist seg at det, i motsetning til 5′ UTR, er en eksponentiell sammenheng mellom lengden på 3′ UTR og de cellulære og morfologiske kompleksitetene til en organisme. Denne korrelasjonen antyder at 3′ UTR, som mRNA-kodeområdene, har blitt utsatt for naturlig utvalg for å tillate stadig mer kompleks posttranskripsjonsmodulasjon gjennom evolusjon¹⁷. 3′ UTR inneholder flere bindende steder for proteiner og miRNAer som påvirker stabiliteten og oversettelsen av transkripsjonen.

I det nåværende arbeidet utviklet vi et verktøy for å undersøke rollen som svært bevarte domener i 3′ UTR av en GOI for kontroll av transkripsjonsstabilitet. Vi fokuserte på epitelnatriumkanalen, alfa-underenheten (αENaC), som spiller en nøkkelrolle i alveolær epitelfysiologi¹⁸. Alveolære epitelceller i primærkulturen ble vellykket transiently transfected med de to komponentene i Tet-Off-systemet, noe som gjør det mulig for studiet av rollen til 3 ‘ UTR i mRNA stabilitet med et system som minimalt påvirker cellefysiologi og metabolisme i forhold til bruk av transkripsjonshemmere med andre protokoller. En kloningstrategi ble utviklet for å skille uttrykket av GOI fra det endogene genet ved hjelp av en nonendogenously uttrykt epitop (V5). Responsen og regulatoriske plasmider ble deretter overført til alveolære epitelceller ved hjelp av en pipetteelektroporasjonsteknikk. Deretter ble uttrykket av transkripsjonen målt ved å inkubere cellene med doxycyklin med forskjellige tidsintervaller. Halveringstiden av transkripsjonen ble evaluert av RT-qPCR med en modifisert Cq-metode ved hjelp av det transinfiserte tTA-Ad mRNA-produktet for normalisering. Gjennom vår protokoll tilbyr vi en praktisk måte å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon under forskjellige forhold og definere involveringav de uoversatte regionene mer detaljert.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene fra Canadian Council on Animal Care og ble godkjent av Institutional Animal Care Committee of the Research Center of Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM). 1. Design og generering av responsen plasmid uttrykker genet av interesse (GOI) Bruk en indusibel tetracyklin-off vektor, for eksempel pTRE-Tight. Analyser sekvensen av GOI og flere kloning området (MCS) av vektoren for å identifisere beg…

Representative Results

Denne protokollen ble vellykket brukt til å generere et Tet-Off transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem for å evaluere betydningen av ulike deler av αENaC 3 ‘ UTR i modulering av transkripsjonstabilitet i primære alveolære epitelceller. Det første trinnet i gjennomføringen av dette systemet var å etablere en rask, enkel og effektiv transfection teknikk for alveolære epitelceller i primærkulturen, som er vanske…

Discussion

Den lave transfection rate av alveolære epitelceller i primærkulturen har vært en alvorlig begrensning for bruk av Tet-Off-systemet for å vurdere mRNA stabilitet i disse cellene. Denne begrensningen ble imidlertid overvunnet av pipetteelektroporasjon, slik at en 25-30% transfection effektivitet (Figur 1 og figur 3)²⁶.

Målingen av transkripsjonstabilitet er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gi…

Materials

Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Chloroform – Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast	Leica	–
DNase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068015
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Ethanol – Molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol – Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	I9516
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB Broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, powder	Gibco	61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets	ThermoFisher Scientific	51025413
Mupid-exU electrophoresis system	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
pTet-Off Advanced vector	Takara Bio	631070
pTRE-Tight vector	Takara Bio	631059
Purified alveolar epithelial cells	n.a.	n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	R&D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Approved FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Water, Molecular biology Grade	Wisent Bioproducts	809-115-EL