Эффективная транскрипционно контролируемая система выражения плазмида для исследования стабильности транскриптов мРНК в первичных альвеолярных эпителиальных клетках
Summary
Здесь мы представляем инструмент, который может быть использован для изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в первичных альвеолярных эпителиальных клетках с помощью индуцируемой системы выражения в сочетании с техникой электропорации пипетты.
Abstract
Изучение посттранскриптона регулирования имеет основополагающее значение для понимания модуляции данной РНК-мессенджера (мРНК) и ее влияния на гомеостаз клеток и обмен веществ. Действительно, колебания в выражении стенограммы могут изменить эффективность перевода и, в конечном счете, клеточную активность стенограммы. Несколько экспериментальных подходов были разработаны для изучения период полураспада мРНК, хотя некоторые из этих методов имеют ограничения, которые препятствуют надлежащему изучению посттранскриптонной модуляции. Система индукции промотора может выразить ген интереса под управлением синтетического тетрациклина-регулируемого промоутера. Этот метод позволяет полураспада оценки данного мРНК при любом экспериментальном состоянии без нарушения гомеостаза клеток. Одним из основных недостатков этого метода является необходимость трансфектных клеток, что ограничивает использование этого метода в изолированных первичных клетках, которые очень устойчивы к обычным методам трансфекции. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре широко используются для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. Уникальные характеристики и фенотип первичных альвеолярных клеток делают необходимым изучение посттранскриптовых модуляций генов, представляющих интерес в этих клетках. Таким образом, наша цель состояла в разработке нового инструмента для изучения посттранскриптовых модуляций мРНК, представляющих интерес для альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре. Мы разработали быстрый и эффективный переходный протокол претворения для вставки транскрипционно контролируемой системы выражения плазмида в первичные альвеолярные эпителиальные клетки. Эта стратегия клонирования, используя вирусный эпитоп, чтобы пометить конструкцию, позволяет легко дискриминации построить выражение от эндогенных мРНК. Используя модифицированный метод количественного цикла (Cq), выражение стенограммы может быть количественно с разной временной интервалами для измерения его полураспада. Наши данные демонстрируют эффективность этого нового подхода при изучении посттранскриптонной регуляции в различных патофизиологических условиях в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.
Introduction
Для определения периодов полураспада мРНК было разработано несколько методов. Метод распада пульса-погони, который использует помеченные мРНК, позволяет одновременно оценить большой пул мРНК с минимальными клеточными нарушениями. Тем не менее, этот подход не позволяет прямой оценки период полураспада одного гена стенограммы и не может быть реализован для изучения посттранскриптовой модуляции мРНК после стимуляции с факторами роста, ROS, alarmins, или воспаление1.
Использование ингибиторов транскрипции, таких как актиномицин D и аманитин, является относительно простым методом измерения кинетики деградации мРНК с течением времени. Одним из основных преимуществ этого подхода по сравнению с предыдущими методами (т.е. пульс-погони) опирается на способность непосредственно оценить период полураспада данной стенограммы и сравнить, как различные методы лечения могут повлиять на его деградации кинетики. Однако значительное пагубное воздействие ингибиторов транскрипции на физиологию клеток представляет собой основной недостаток подхода2. Действительно, ингибирование всей транскриптома клеток этими препаратами имеет негативный побочный эффект возмущения синтеза ключевых элементов, участвующих в стабильности мРНК, таких как микроРНК (миРНК), а также экспрессии и синтеза РНК-связывающих белков, которые важны для деградации и стабильности мРНК. Тяжелые возмущения транскрипции генов этими препаратами может поэтому artefactually изменить деградации кривые транскриптов.
Система индукции промоутера представляет собой третий подход к измерению период ы полураспада конкретной мРНК. Этот метод измеряет деградацию конкретной мРНК так же, как методы, которые используют ингибиторы транскрипции. Часто используются два типа индукционных систем: сывороточный сывороточный сик-фос-промоутер3 и индуцируемая система Tet-Off4. С системой c-fos, использование ингибиторов транскрипции, которые могут быть токсичными для клетки не требуется. Однако этот метод требует синхронизации клеточного цикла, что препятствует оценке фактической стабильности транскрипта во время межфазы5. В отличие от этого, система Tet-Off позволяет сильное выражение гена интереса (GOI) под контролем синтетического тетрациклина регулируется промоутер. Эта система требует присутствия двух элементов, которые должны быть cotransfected в клетку, чтобы быть функциональным. Первый плазмид (pTet-Off) выражает регулятивный белок tTA-Adv, гибридный синтетический транскрипционный фактор, состоящий из прокариотического репрессора TetR (от Escherichia coli), слитого с тремя транскрипционными трансформаторными доменами из вирусного белка HSV VP16. GOI клонируется в pTRE-Tight плазмид под контролем синтетического промоутера (PTight),включающего минимальную последовательность цитомегаловируса (CMV) промоутер сливается с семью повторами тетро оператора последовательности. Транскрипция гена вниз по течению PTight зависит от взаимодействия TetR с тетро. При наличии тетрациклина или его производного, доксициклина, репрессор TetR теряет свою близость к оператору тетро, что приводит к прекращению транскрипции4. Характеристики системы Tet-Off делают ее идеальной моделью для изучения специфического выражения мРНК в эукариотических клетках, избегая при этом потенциальных плейотропных эффектов, которые являются вторичными по отношению к отсутствию прокариотических регуляторных последовательностей в эукариотических клетках6. Как правило, вдвойне стабильные линии клеток Tet-Off (HEK 293, HeLa и PC12) используются с этой системой для интеграции копий регулятора и плазмидов реагирования для удобного доступа к управляемому экспрессии генов7,8,9.
Несколько моделей альвеолярных эпителиальных клеток в культуре были использованы для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. В течение многих лет, исследователи широко использовали человека или грызунов первичных клеток10,11, а также увековеченные клеточные линии, такие как человека A549 или крысы RLE-6TN клетки12,13. Хотя они, как правило, менее пролиферативной и более трудной для культуры и трансфекта, альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре остаются золотым стандартом для изучения функции и дисфункции альвеолярного эпителия в физиологических и патологических условиях. Действительно, увековеченные клеточные линии, такие как клетки A549, не обладают сложными характеристиками и фенотипами первичных клеток, в то время как альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре переизгладируют основные свойства альвеолярного эпителия, в частности способность формировать поляризованный и плотный барьер14,15. К сожалению, эти клетки очень устойчивы к обычным методам трансфекции, таким как те, которые используют липосомы, что делает использование системы, индуцированной промоутером, такой как Tet-Off, очень трудно.
Посттранскриптовая модуляция мРНК является одним из наиболее эффективных методов быстрого модулирования экспрессии гена стенограммы16. Важную роль в этом механизме играет непереведенный регион mRNA 3′(3′ UTR). Было показано, что, в отличие от 5′ UTR, существует экспоненциальная корреляция между длиной 3′ UTR и клеточной и морфологической сложности организма. Эта корреляция предполагает, что 3′ UTR, как и мРНК кодирования регионов, был подвергнут естественному отбору, чтобы все более сложным посттранскриптонных модуляции на протяжении всей эволюции17. 3′ UTR содержит несколько связывающих сайтов для белков и miRNAs, которые влияют на стабильность и перевод стенограммы.
В настоящей работе мы разработали инструмент для изучения роли высоко сохраненных доменов в 3′ UTR GOI для контроля стабильности транскрипта. Мы сосредоточились на эпителиальном канале натрия, альфа-субъединице (ЗенаК), который играет ключевую роль в альвеолярной эпителиальной физиологии18. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре были успешно преходяще трансинфицированы двумя компонентами системы Tet-Off, что позволяет изучать роль 3′ UTR в стабильности мРНК с системой, которая минимально влияет на физиологию и метаболизм клеток по сравнению с использованием ингибиторов транскрипции с другими протоколами. Была разработана стратегия клонирования, чтобы дифференцировать экспрессию ГОИ от эндогенного гена с использованием неэндогенно выраженного эпитопа (V5). Реакция и регулятивные плазмиды затем были перенесены в альвеолярные эпителиальные клетки с использованием техники электропорации пипетки. Впоследствии экспрессия транскрипта измерялась путем инкубации клеток доксициклином с разными интервалами времени. Период полураспада стенограммы был оценен RT-qPCR с помощью модифицированного метода Cq с использованием трансинфицированного продукта tTA-Ad mRNA для нормализации. В рамках нашего протокола мы предлагаем удобный способ изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в различных условиях и более подробного определения участия непереведенных регионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Низкий уровень трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре был серьезным ограничением для использования системы Tet-Off для оценки стабильности мРНК в этих клетках. Тем не менее, это ограничение было преодолено электропорации пипетки, что позволило 25-30% эффективн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Фрэнсис Миньо был поддержан стипендией, предоставленной Квебекской сетью респираторного здоровья и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR), студентом из ФСКН и студентом из факультета по вопросам медицины и науки и Постдокторсал, Монреальский университет. Эта работа была поддержана председателем Госселин-Ламарре в области клинических исследований и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (YBMOP-79544).
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. 암 연구학. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3’UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3’UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3′ Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l’ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3′ non traduites. , (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
